HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Ursachen für mangelnde Robustheit

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Sie übernehmen eine validierte Methode, die allerdings im Laufe der Zeit sich nicht als sonderlich robust erweist. Wieso gibt es immer wieder Probleme mit der Robustheit von validierten bzw. offiziellen Methoden (DAB, PharmEura usw.)?

Die Lösung

Das grundsätzliche Problem – eher ein Management- denn ein analytisches Problem – besteht darin, dass die Zeit, die für die Validierung einer Methode zur Verfügung steht, meist nicht ausreicht, um die Eignung besagter Methode unter Routinebedingungen zu überprüfen. Eine „Validierung“ unter optimalen Bedingungen und zusätzlich unter Zeitdruck liefert unweigerlich „Sonntagswerte“, die mit dem realen Alltag denkbar wenig zu tun haben. Das Validierungselement nun, dass in solcher Situation fast immer zu kurz kommt, ist eben die Robustheit. Einige Fragen, die in diesem Zusammenhang zu klären wären, sind:

•Wurden bei der Validierung reale Proben verwendet, bei Bedarf eventuell solche speziell für diesen Zweck synthetisch hergestellt?

•Wurde der Einfluss vom Ultraschallbad auf die Stabilität der Probe während des Auflösevorgangs gebührend (wenn überhaupt...) untersucht?

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•Wurden mehrere Chargen der stationären Phase überprüft?

•Wurde die Haltbarkeit von Lösungen/Reagenzien in Abhängigkeit vom Behältnis untersucht, zum Beispiel Glas/Kunststoff, Braunglas/Weißglas, mit/ohne Aluminiumfolie usw.?

•Wie ist es mit dem Einfluss der Hardware, so beispielsweise Hochdruck-/Niederdruckgradient, Stahl-/Peekkapillaren, Ansaugfitte aus Stahl/Keramik/Glas/Peek?

Es folgen einige kritische Punkte chromatographischer Natur:

pH-Wert: Keine explizite Messung bzw. Einstellung des pH-Wertes des Eluenten.

Puffer: Falscher Puffer (zum Beispiel Acetat bei pH = 3), schwacher Puffer (zum Beispiel 1 g Kaliumhydrogenphosphat pro

Liter Eluent bei stark ionischen Analyten) „aggressiver“ Puffer (zum Beispiel Citrat im Sauren, Carbonat im Alkalischen).

pKS-Wert: Man arbeitet in unmittelbarer Nähe des pKS-Wertes, die Gefahr lautet: Winzige Änderungen des pH-Wertes des Eluenten führen zu Retentionszeit-Sprüngen. Der robuste Bereich befindet sich unterhalb/oberhalb einer pH-Einheit vom pKS-Wert.

Polare RP-Säule in der Routine:´Es ist so, dass polare RP-Phasen – auch moderne! – immer wieder Probleme sowohl bezüglich Chargenreproduzierbarkeit als auch bzgl. Stabilität im Routinebetrieb zeigen. Man muss leider Gottes häufig zwischen Selektivität und Robustheit entscheiden.

Das Fazit

Jede Stunde, die in die Prüfung der Robustheit einer Methode in einem frühen Stadium investiert wird, ist eine „goldrichtige“ Investition. Jede Wiederholmessung im Routinebetrieb durch „Out of Spec“-Situationen oder Reklamation stellt vermeidbare Fehler- oder Produktionskosten dar.© by Stavros Kromidas

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