Automatisierte Vorsäulenderivatisierung
Aminosäureanalytik
In der Biochemie, Pharmazie und im Lebensmittelbereich spielt die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit Fluoreszenzdetektor eine bedeutende Rolle in der Aminosäureanalytik, insbesondere in Verbindung mit der Vorsäulen- und Nachsäulenderivatisierung der Aminosäuren. Die Automatisierung dieser Derivatisierungsschritte ist ein Fortschritt für verbesserte Analysen. Mit dem Einsatz von Autosamplern und Automatisierungstechnologien können Effizienz, Reproduzierbarkeit und Genauigkeit verbessert werden. Im Folgenden wird eine Methode zur automatisierten Vorsäulenderivatisierung von Aminosäuren beschrieben.
Die Zusammensetzung und Gehalte von Aminosäuren können ein entscheidendes Kriterium für die Zulassung spezieller Lebensmittel und von Pharmazeutika sein. Die HPLC mit Fluoreszenzdetektor ist ein empfindliches und selektives "Werkzeug" für Aminosäure-Analysen. Um die Aminosäuren für diese Detektionsmethode allerdings zugänglich zu machen, ist eine Derivatisierung der Analyten erforderlich. Hierfür stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Die Derivatisierung bzw. die Zugabe der Reagenzien für die Derivatisierung kann manuell [1] oder mit einem externen Pipettierautomaten [2] durchgeführt werden. Eine alternative Methode ist die Nachsäulenderivatisierung von Amino- und Iminosäuren nach der von Watanabe entwickelten Methode [3]. Eine andere gängige Derivatisierungsmethode verwendet das Reagenz o-Phthaldialdehyd (OPA), das nach oder vor der analytischen Trennung mit den Aminosäuren reagiert [4]. Sekundäre Aminosäuren wie Prolin werden häufig mit 9-Fluorenylmethoxycarbonylchlorid (FMOC) derivatisiert, da sie nicht mit OPA reagieren [5].
Obwohl die Nachsäulenderivatisierung für die Aminosäureanalyse mit HPLC eine gängige Methode z. B. in sogenannten Aminosäureanalysatoren ist, bringt sie auch Nachteile mit sich. Dazu zählen die lange Analysezeit aufgrund der Eigenschaften der Säule, eine recht komplexe Instrumentenkonfiguration sowie ein recht hoher Verbrauch an Fließmitteln und Derivatisierungsreagenzien. Auch über eine Vorsäulenderivatisierung kann eine schnelle und einfache Analyse von Aminosäuren möglich sein, jedoch können Derivatisierungsvorgang und der Einfluss der Matrix Probleme verursachen. Durch neuere Entwicklungen in der Autosampler-Technik können diese Derivatisierungsschritte mit Hilfe automatisierter Funktionen zur Probenvorbehandlung direkt im Autosampler erfolgen und damit den Arbeitsaufwand minimieren. Dabei werden die Proben direkt vor der HPLC-Trennung entweder in einem separaten Reaktionsgefäß oder in der Injektionsnadel des Autosamplers derivatisiert.
Vorsäulenderivatisierung
Bei der Vorsäulenderivatisierung erfolgt die chemische Modifikation der Aminosäuren vor der chromatographischen Trennung. Die Derivatisierung ist für die Detektion der Aminosäuren mit dem Fluoreszenz-Detektor erforderlich. Bild 1 zeigt Möglichkeiten, Aminosäuren mit einem geeigneten Derivatisierungsmittel umzusetzen, um ein stabiles, über die Fluoreszenz detektierbares Derivat zu erhalten. Dies kann unter verschiedenen Bedingungen ablaufen, wie beispielsweise bei erhöhter Temperatur oder in Gegenwart eines Katalysators.
Die Wahl des Derivatisierungsmittels hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie z. B. der Art der Aminosäure und der Detektionsmethode. So eignet sich wie oben genannt OPA besonders für primäre Aminosäuren, während FMOC-Chlorid vor allem für sekundäre Aminosäuren wie Prolin verwendet wird. Die Reaktionsbedingungen wie z. B. pH-Wert, Temperatur und Reaktionszeit sind entscheidend für eine effiziente Derivatisierung. Eine sorgfältige Optimierung dieser Bedingungen ist erforderlich, um eine vollständige und reproduzierbare Derivatisierung der Aminosäuren zu gewährleisten.
Derivatisierung in der Autosampler-Nadel
Es ist auch möglich, die Derivatisierung in der Nadel des Autosamplers durchzuführen. So kann eine Derivatisierung mit einer einfachen Systemkonfiguration automatisiert erfolgen. Eine neu entwickelte Methode zur Probenvorbereitung ermöglicht die direkte Aminosäurederivatisierung in der Autosampler-Nadel, selbst bei sehr geringen Probenvolumina von 1 µl [6]. Dies ermöglicht eine effiziente Nutzung der Proben und eine verbesserte Produktivität in der Analytik. Hierfür wurde das HPLC-System Nexera LC-40XR (LPGE), der Autosampler SIL-40XR und der Fluoreszenzdetektor RF-20Axs (alle von Shimadzu) verwendet. Die frei programmierbare integrierte Funktion zur Probenvorbehandlung ("Pretreatment"-Funktion) des Autosamplers ermöglicht eine automatisierte Durchführung verschiedener Vorbehandlungsschritte: Der Autosampler pipettiert die Probe und die erforderlichen Reagenzien zunächst in der Injektionsnadel, mischt sie dort und injiziert anschließend die derivatisierte Probe direkt in den analytischen Flussweg des HPLC-Systems. Diese Methode reduziert den Arbeitsaufwand, verbessert die Genauigkeit der Analyse und ermöglicht eine effiziente Probenvorbereitung. Bild 2 veranschaulicht den Prozess und zeigt die Methodenparameter. Es wurde OPA-Reagenzlösung, 3-Mercaptopropionsäure (MPA) und ein Borat-Puffer verwendet. Um die Derivatisierung präzise und stabil zu halten, wurde am Ende der Reaktion eine verdünnte Phosphorsäurelösung hinzugefügt. Ein Niederdruckgradient mit drei Lösungsmitteln wurde verwendet, wobei unterschiedliche pH-Werte mit Natriumacetat-Puffer eingestellt wurden, ergänzt durch ein Wasser/Acetonitril-Gemisch. Eine Standard-C18-Säule diente als stationäre Phase.
Bei Verwendung der automatisierten Derivatisierungsmethode konnten mithilfe einer Aminosäurestandardlösung alle 20 proteinogenen Aminosäuren innerhalb eines 15-minütigen Analysezyklus chromatographisch getrennt werden (s. Bild 3). Die Methode wurde auf ihre Linearität und Wiederholbarkeit für die 20 proteinogenen Aminosäuren im Konzentrationsbereich von 1 bis 100 µmol/l mittels externer Kalibration getestet. Dabei wurde ein hohes Bestimmtheitsmaß (R2) von über 0,999 für alle Aminosäuren erzielt. Die relative Standardabweichung der Peakfläche für primäre Aminosäuren lag unter 1,7 %. Diese Ergebnisse betonen die präzise und reproduzierbare quantitative Analyse der Aminosäuren mithilfe dieser Methode.
Mit dem Einsatz einer Lösungsmittelpumpe mit Niederdruckgradientensystem (LPGE) in Kombination mit einem Autosampler mit schneller, präziser und verschleppungsarmer Injektionstechnik sowie speziellen automatisierten Funktionen zur Probenvorbehandlung und einem empfindlichen Fluoreszenzdetektor war es möglich, eine schnelle und robuste Analysenmethode für Aminosäuren zu entwickeln.
Probenvorbereitung mit Sorgfalt
Die Probenvorbereitung ist entscheidend bei der Analyse von Aminosäuren. Hier kommen potenzielle Variationen in der Probenmatrix und mögliche Störungen zum Tragen. Reproduzierbarkeitstests in verschiedenen Lebensmittelmatrices haben gezeigt, dass die Wiederfindungsraten der einzelnen Aminosäuren variieren können [7]. Bild 4 zeigt die Ergebnisse von Untersuchungen an verschiedenen Lebensmitteln bei Verwendung der hier beschriebenen Analysemethode mit der Derivatisierung in der Injektionsnadel. Die Wiederfindungsraten lagen konstant auf einem hohen Niveau, was die Eignung der vorgestellten Methode auch für unterschiedliche Lebensmittelmatrices zeigt.
Eine saubere Arbeitsweise ist außerdem von großer Bedeutung, da Aminosäuren allgegenwärtig sind und Verunreinigungen somit leicht auftreten können. So können Kontaminationen, die beispielsweise durch Hautkontakt verursacht werden, das Analyseergebnis erheblich beeinflussen. Daher sind strenge Maßnahmen wichtig, um Kontaminationen zu vermeiden, etwa indem saubere Handschuhe und geeignete Arbeitsgeräte verwendet werden. Darüber hinaus sollten sorgfältige Reinigungsschritte für die verwendeten Geräte und Utensilien erfolgen, um Verfälschungen der Ergebnisse zu vermeiden. Eine präzise Probenvorbereitung, angepasst an die jeweilige Probenmatrix, ist maßgebend für eine zuverlässige Analyse der Aminosäuren und trägt zur Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse bei.
Fazit
Die vorgestellte Methode zur automatisierten Vorsäulenderivatisierung in der Autosampler-Nadel bietet Vorteile bei der Aminosäureanalytik. Durch die Integration der Derivatisierung direkt vor der HPLC-Trennung wird der Aufwand für die Probenvorbereitung minimiert und die Effizienz gesteigert. Die selektive und empfindliche Detektion der derivatisierten Aminosäuren mit dem Fluoreszenzdetektor ermöglicht präzise Ergebnisse. Diese Automatisierung bietet somit eine effiziente und zuverlässige Methode zur Analyse von Aminosäuren in verschiedenen Anwendungsbereichen wie Lebensmittel und Arzneimittel.
Literatur
[1] H. Umagat, P. Kucera, L.-F. Wen, Journal of Liquid Chromatography, 1982, 239, 463–474.
[2] D. Heems, G. Luck, C. Fraudeau, E. Vérette, Journal of Chromatography A, 1998, 798, 9–17.
[3] Y. Watanabe, K. Imai, Analytical Chemistry, 1983, 55, 1786–1791.
[4] B. N. Jones, S. Pääbo, S. Stein, Journal of Liquid Chromatography, 1981, 4, 565–586.
[5] S. Einarsson, Journal of Chromatography A, 1985, 348, 213–220.
[5] M. Hayakawa, Shimadzu Application News 01-00441-EN, 2022.
[6] M. Hayakawa, Shimadzu Application News 01-00446-EN, 2022.
AUTOR
Stephan Neumann
Produktspezialist HPLC
Shimadzu Deutschland GmbH
Tel.: 0203 7687-0
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