Optimierung der Peakkapazität in der Gradienten-UHPLC

Mehr Trennleistung für Multikomponentengemische

Das Konzept der Peakkapazität ist umfassender als jenes der theoretischen Trennstufenzahl, denn es vereint sowohl die Säulencharakteristik, als auch die Laufzeit der Trennung.

© Fotolia/shooting88

Insbesondere Sub-2-Micron-Säulen stellen im Gradientenbetrieb mit aktuellen UHPLC-Systemen schnelle Chromatogramme mit wesentlich höheren Peakkapazitäten zur Verfügung, als bisher angenommen wurde. Überraschende Erkenntnisse und ein kleiner Leitfaden zur Methodenentwicklung sollen helfen, Mehrkomponentengemische noch besser und schneller aufzutrennen.

Die Auflösung R ist in der Chromatographie eine der wichtigsten Kenngrößen und in vielen Fällen das Maß aller Dinge. Die zugrunde liegenden Gleichungen unterstreichen die hohe Bedeutung der Selektivität, den Einfluss der Retention und belegen die ernüchternde Erkenntnis, dass die Auflösung lediglich mit der Quadratwurzel der Säulenlänge steigt. Ebenso wie die fundamentale Van-Deemter-Gleichung gelten diese Zusammenhänge aber ausschließlich für die isokratische (U)HPLC. Die chromatographische Leistungsfähigkeit beruht dabei auf der theoretischen Trennstufenzahl, die von der Partikelgröße, der Packungsqualität und der Länge der Trennsäule abhängt. Da sich die Trennstufen über die Peakbreite bei isokratischen Elutionsbedingungen definieren, sind sie ein wenig aussagekräftiger Gradmesser für die chromatographische Leistung bei Gradiententrennungen. Während bei isokratischem Betrieb Diffusionsprozesse die Peaks mit zunehmender Laufzeit verbreitern, kommt es zu Beginn eines Gradientenlaufes sogar zur Fokussierung von Analyten am Säulenkopf.

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Um auch für Gradiententrennungen die Leistungsfähigkeit gut messen zu können, wurde das Konzept der Peakkapazität entwickelt. Es beschreibt die Anzahl der Peaks, die in einer bestimmten Zeit mit einer definierten Auflösung getrennt werden können. Wenn die Trennstufenzahl der Maßstab in der isokratischen Flüssigkeitschromatographie ist, dann ist die Peakkapazität das Maß aller Dinge für die Trennleistung in der Gradienten-(U)HPLC. In der Literatur sind verschiedene Definitionen zu finden, die sich sowohl in der Vorgabe der Auflösung (oft mit R = 1 oder mit Basislinientrennung R = 1,5) als auch in der Zeitspanne (z. B. von der Totzeit bis zum k-Wert eines bestimmten Peaks) unterscheiden können oder allgemein als „Anzahl Peaks pro Zeiteinheit“ auftreten. Für Vergleiche sind entweder die Bedingungen konstant zu halten oder jeweils exakt anzugeben.

Höchste Wahrscheinlichkeit alle Peaks zu trennen

Besonders in der Multikomponenten-Analytik von komplexen Proben mit einer Vielzahl an bekannten, aber auch unbekannten Substanzen, ist dieses Konzept von besonderer Bedeutung. Je höher die Peakkapazität ist, desto wahrscheinlicher ist die Auftrennung aller Peaks in verschiedenen Proben.

Als Orientierungshilfe für die Größenordnungen darf Folgendes angenommen werden:

  • die Auflösung der Peaks gilt als deutlich beeinträchtigt, wenn die Anzahl der Analyten 1/3 der Peakkapazität übersteigt [1]
  • die Peakkapazität muss die Anzahl der Komponenten um den Faktor 100 übertreffen, um 98 % aller Komponenten gut aufzutrennen [2]

Der skandinavische HPLC-Spezialist Dr. Patrik Petersson hat hauptsächlich mit Sub-2-Micron-Materialien und auch Superficially Porous-Partikeln (SPP) umfangreiche Optimierungsexperimente zur Maximierung der Peakkapazität und zur Beschleunigung von RP-Gradiententrennungen durchgeführt [3]. Zur Unterstützung seiner Realmessungen wurden auch zwei verschiedene Computer-Simulationsprogramme für die HPLC eingesetzt.

Die wichtigsten praktischen Erkenntnisse sollen – mit seiner persönlichen Genehmigung – hier kurz zusammengefasst und daraus eine Empfehlung für die Optimierung der Peakkapazität abgeleitet werden.

Hohe Flussraten

Es wäre zu erwarten, dass es bei hohen Flussraten und langen Gradienten, durch zunehmende Widerstände beim Massentransfer, zu einem Rückgang der Peakkapazität kommen sollte. Bei kleinen Molekülen kommt es aber erstaunlicherweise sogar zu einer Steigerung der Peakkapazität. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass die Reduktion der Peakbreite, welche mit steigender Flussrate einhergeht, in diesen Fällen überwiegt.

Bild 1: Verbesserung der Peakkapazität mit steigender Flussrate bei drei unterschiedlichen Partikeltypen. (Bild: Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Patrik Petersson [3]) © Dr. Patrik Petersson

Wie Bild 1 zeigt, gilt das nicht nur für vollporöses 3 µm-Material (braun), sondern besonders für 1,7 µm-Partikel (grün) und SPP-Teilchen (2,7 µm; schwarz). Die hier dargestellten Zusammenhänge sind nur für Analyten mit Molekulargewichten unter ca. 1 300 Dalton zutreffend. Sehr große Moleküle hingegen zeigen den erwarteten Verlust an Peakkapazität bei hohen Flussraten. In anderen Publikationen gezeigte Untersuchungen bestätigen den Vorteil hoher Flussraten bei 1,8 µm-Partikeln [4][5]. Der Zusammenhang zwischen Peakkapazität und der Gradientenzeit bei zwei verschiedenen Flussraten wird dabei in Bild 2 deutlich. Der schnelle 5-Minuten-Gradient erzeugt bei einer hohen Flussrate von 2 ml/min (grün, oben) die gleiche Peakkapazität wie ein fünfmal so langer Gradient bei 0,4 ml/min (blau, unten) auf derselben Säule.

Bei langsamerem Fluss (0,4 ml/min, blau) lässt sich die Peakkapazität auf geringem Niveau durch fünffache Verlängerung der Gradientenzeit in etwa verdoppeln. Dieselbe Säule mit einem Fluss von 2 ml/min betrieben beginnt mit der gleichen Peakkapazität schon bei der kurzen Gradientenzeit und steigert die Peakkapazität durch dieselbe Zeitverlängerung ebenfalls auf das Doppelte, jedoch auf deutlich höherem Niveau (grün).

Auch die Ergebnisse der grundlegenden Arbeiten von Dr. Petersson [3] beweisen, dass mit kurzen Gradienten und hohen Flüssen bessere Peakkapazitäten zu erzielen sind, als mit langen Gradienten bei langsamen Flussraten. Das erfordert allerdings eine UHPLC-Ausrüstung, die z. B. 2 ml/min bis über 1 000 bar reproduzierbar zur Verfügung stellt.

Selektivität

Liegt das Ziel darin, sehr wenige oder lediglich zwei Analyten zu separieren, dann ist die Selektivität das wichtigste Kriterium der Optimierung, die dann meist auf kurze Analysenzeiten abzielt. Die Selektivität zwischen zwei Analyten definiert sich als der Quotient der beiden Retentionsfaktoren, und sie bleibt bei der klassischen isokratischen HPLC konstant.

Bild 2: Verdoppelung der Peakkapazität durch Verlängerung der Gradientenzeit bei unterschiedlichen Flussraten [4]. © Agilent Technologies

Bei den stark zunehmenden Multikomponenten-Analysen mit komplexen Gemischen kann nicht mehr auf die divergierenden Selektivitätsanforderungen aller Peakpaare eingegangen werden, und die Peakkapazität tritt in den Fokus der Methodenentwicklung. Hier kommt man mit der isokratischen LC nicht mehr aus, sondern ist auf die Gradienten-Betriebsweise angewiesen. Grundsätzlich steigt die Peakkapazität bei der Gradientenelution linear mit dem Bereich der Konzentrationsänderung der Laufmittelzusammensetzung, daher sollte dessen Spannweite möglichst groß gewählt werden.

Bei der Trennung mittels Gradienten-LC bleibt die Selektivität aber nur konstant, wenn sich die Steigung des Gradienten nicht ändert. Um eine angestrebte Selektivität und damit Gradientensteigung auf gleichem Niveau zu halten, muss bei langen Gradientenzeiten die Flussrate reduziert werden bzw. erfordern kurze Gradientenzeiten entsprechend hohe Flüsse. Im letzteren Fall wird die Analyse dadurch beschleunigt.

Die Erhöhung der Flussrate bei konstanter Gradientenzeit flacht den Gradienten ab und vergrößert die Retention und das Peakvolumen. Damit verbessert sich erfreulicherweise nicht nur die Peakkapazität, die Trennung wird auch schneller [3].

Bild 3: 3D-Darstellung der Peakkapazität (P) von drei Säulenlängen in Abhängigkeit von Gradientenzeit (tG) und Flussrate (F). Die gestrichelten Linien kennzeichnen die Druckgrenze von 800 bar (Innendurchmesser: 2,1 mm; Partikelgröße: 1,7 µm; Acetonitril-Gradient (5 – 95 %) bei 60 °C). © Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Patrik Petersson [3]

Da sich die Trennselektivität der Gradienten-LC mit unterschiedlichen Gradientensteigungen verändert, ist es nicht immer offensichtlich, ob bei der optimalen Peakkapazität der Gesamttrennung auch die maximale Auflösung zwischen einem bestimmten Peakpaar erzielt wird. In der Praxis sind bei Änderungen der Gradientensteigung sogar Umkehrungen in der Elutionsreihenfolge möglich. In solchen Fällen muss individuell entschieden werden, ob die Auflösung eines kritischen und/oder wichtigen Peakpaares bei einer eventuell niedrigeren Flussrate wichtiger ist oder doch die maximale Peakkapazität für die Auflösung der meisten Komponenten höchste Priorität hat.

Kurze Säulen

Auf den ersten Blick sollte man erwarten dürfen, dass die Peakkapazität mit der Säulenlänge ansteigt. Tatsächlich können jedoch mit kurzen Säulen oft höhere Peakkapazitäten gewonnen werden als mit langen Säulen bei niederen Flussraten. Die komplexen Zusammenhänge sind in Bild 3 anschaulich zusammengefasst [3].
Vorausgesetzt der Druck wird auf 800 bar begrenzt und die Gradientenzeit auf 5 Minuten eingeschränkt, erzielt die 50 mm-Säule nicht nur die kürzesten Retentionszeiten tg (1,5 versus 3 Minuten), sondern zeigt auch noch eine höhere Peakkapazität P (258 versus 221) als die dreimal so lange Säule (Bild 3, untere Auflistungen). Erst bei sehr langen Gradientenzeiten hat die mittlere Säule eine etwas höhere Peakkapazität als die kürzeste, der Unterschied zwischen 150 mm und 100 mm Säulenlänge ist mit 3 % überhaupt vernachlässigbar klein (Bild 3, obere Auflistungen).

Bild 4: Peakkapazität von unterschiedlichen Säulenlängen mit entsprechenden Flussraten bei jeweils 800 bar (Acetonitril-Gradient bei 60 °C). © Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Patrik Petersson [3]

Den Zusammenhang zwischen Peakkapazität und Säulenlänge zeigt Dr. Petersson in Bild 4 auf. Die drei Säulenlängen wurden mit der jeweils maximalen Flussrate betrieben, die 800 bar Rückdruck ergaben. Für Gradientenzeiten unter 6 Minuten stellt wiederum die kürzeste Säule (blau) die beste Peakkapazität zur Verfügung. Bis zu einer Gradientenzeit von 30 Minuten ist die mittlere 100 mm-Säule (grün) der längsten überlegen, und erst bei noch höherer Zeitinvestition hat die 150 mm-Säule Vorteile bei der Trennleistung. Die drei Markierungen von „k = 10“ in der Grafik zeigen auch, dass große Unterschiede in der Flussrate und der Gradientenzeit notwendig sind, um den gleichen sog. „momentanen Retentionsfaktor“ für verschiedene Säulenlängen zu erhalten (der momentane Retentionsfaktor ist der Retentionsfaktor, wenn sich der Analyt auf halbem Weg durch die Säule bewegt hat).

Höhere Temperaturen

Wenn möglich sollte die Temperatur über 40 °C gewählt werden. Höhere Temperaturen verbessern in der HPLC den Massentransfer und dadurch auch die Peakkapazität bei steigenden optimalen Flussraten. Ein zusätzlicher Vorteil von hohen Temperaturen ist die Reduktion der Viskosität des Laufmittels und damit auch die Verringerung des Säulenrückdrucks, was wiederum höheren Flussraten zugutekommt. Die angepeilten hohen Flüsse verringern auch die notwendigen Reequilibrierungszeiten zwischen den Gradientenläufen und beschleunigen so die gesamte Analytik über kurze Zykluszeiten.

Methodenentwicklung

Als praktische Vorgehensweise zur Entwicklung einer UHPLC-Methode (Sub-2-Micron Partikel) mit maximaler Peakkapazität kann unter praktischer Zusammenfassung der oben genannten Erkenntnisse folgendes empfohlen werden:

Peakkapazität ermitteln: Sollte die ungefähre Anzahl der zu erwartenden Peaks (Zielanalyten inkl. Matrixpeaks) bekannt sein, kann der Bedarf an Peakkapazität nach folgender Faustregel abgeschätzt werden: Peakkapazität = (Gesamtkomponentenanzahl) 1,5

Gradientenzeit definieren: Die zu investierende Laufzeit richtet sich nach dem erforderlichen Probendurchsatz und der erwünschten Zykluszeit.

Säulenlänge fixieren: Die geeignete Säulenlänge kann in Abhängigkeit von der Gradientenzeit tG nach folgendem Schema ausgewählt werden:
tG kleiner 5 Minuten → 50 mm Säule
tG zwischen 5 und 30 Minuten → 100 mm Säule
tG über 30 Minuten → 150 mm Säule

Arbeitsdruck begrenzen: Der maximale Arbeitsdruck hängt von den Möglichkeiten der LC-Hardware und auch der Belastbarkeit der Säule ab. 80 % des maximalen Drucks können als robuster Richtwert mit praxisrelevanter Reserve empfohlen werden. Dabei ist unbedingt auch die Steigerung des Rückdrucks durch die Viskositätsänderung während des Gradienten zu berücksichtigen. Acetonitril hat im Gegensatz zu Methanol einen deutlich geringeren Viskositätsanstieg und ist daher unter diesem Aspekt zu bevorzugen.

Säulentemperatur vorgegeben: Die maximale Säulentemperatur ist in Abhängigkeit von der thermischen Stabilität aller Analyten und des Phasenmaterials als Limit festzulegen.

Flussrate maximieren: Abschließend wird die Flussrate soweit erhöht, bis der maximale Arbeitsdruck erreicht wird (z.B. 800 bar).

Bei z. B. 50 Komponenten ist eine Peakkapazität von ca. 350 erforderlich, die mit Sub-2-Micron bei 2 ml/min Fluss und Gradientenzeiten von 10 – 15 Minuten erzielbar sind (Beispiel-Tabellen sind in [5] zu finden).

Fazit

Für kleine Moleküle gilt, dass die Peakkapazität mit der Gradientenzeit und der Flussrate ansteigt. Die deutlichste Verbesserung ist mit der Steigerung des Flusses zu erzielen, als Zusatznutzen wird auch die Analyse verkürzt. Es kann empfohlen werden, Gradientenläufe nicht – wie sehr oft angewandt – nahe dem Van Deemter-Optimum durchzuführen, sondern bei der maximalen Flussrate, welche gerade mit z. B. 800 bar auskommt. Das gilt auch für Systeme, die für 1000 bar geeignet sind, um im Sinne einer robusten Methode genügend Reserven zu haben. Die optimalen Flussraten liegen damit für die Gradienten-LC signifikant höher, als jene die normalerweise von Praktikern verwendet werden. Für 50 – 100 mm-Säulen mit 2,1 mm Innendurchmesser und 1,7 µm-Partikeln sind Flüsse um 1 ml/min nicht ungewöhnlich. Der dabei ansteigende Rückdruck muss allerdings auch von der Säule und der UHPLC-Hardware bewältigt werden können.

Literatur:

  1. Davis, J.C. Giddings: “Statistical Theory of Component Overlap in Multicomponent Chromatograms”, Anal. Chem. 55 (1983) 418.

  2. Giddings: “Sample Dimensionality: a Predictor of Order-Disorder in Component Peak Distribution in Multidimensional Separation”, J. Chromatogr. A, 703 (1995) 3.

  3. Petersson et al: “Maximizing Peak Capacity and Separation Speed in Liquid Chromatography”, J. Sep. Sci. 31 (2008) 2346 – 2357.

  4. Joseph, E. Naegele: „Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system using gradient parameters“, Agilent Publication Nr. 5990-6933EN.

  5. Joseph, E. Naegele: “Maximizing chromatographic peak capacity with the Agilent 1290 Infinity LC system – A practical guide on how to use parameters to increase peak capacity”, Agilent Publication Nr. 5990-6932EN.

AUTOR:

Wolfgang Brodacz
AGES Lebensmittelsicherheit - Kontaminantenanalytik Linz

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