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Der HPLC-Tipp im AugustUSP: die wichtigsten Änderungen zur HPLC

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

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Der HPLC-Tipp im August: USP: die wichtigsten Änderungen zur HPLC

Der Fall

In der Pharmabranche werden vielfach Monographie-Methoden verwendet, somit sind für die Anwender dort Vorgaben der europäischen und der US-Pharmakopöe von Relevanz. Das Kapitel 621 zur Chromatographie in der USP ist nun überarbeitet worden, man konnte Kommentare zum Entwurf bis zum 31. Mai 2012 einreichen (Revision 621, USP35–NF30, General Procedures, Liquid Chromatography Page 258). Somit werden in Kürze die neuen Vorgaben in Kraft treten. Ich werde im vorliegenden HPLC-Tipp die Wichtigsten vorstellen. Zunächst gehe ich auf den Systemeignungstest ein. Damit die Leser ein komplettes Bild erhalten, werde ich in dieser Kurzübersicht auch jene wichtigen Vorgaben erwähnen, die unverändert geblieben sind. Anschließend geht es kurz um die Vorsäule, und ich werde zum Schluss Hinweise, Definitionen und Empfehlungen im USP-Text kommentieren. An dieser Stelle möchte ich Michael Klosky (NOVIA) und Dr. Joachim Ermer (Aventis) für die prompte Zurverfügungstellung des Revisions-Textes herzlich danken.

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Die Lösung

Systemeignungstest (SST):
Aus meiner Sicht sind folgende Punkte wichtig und werden hier aufgeführt:
• Auch in dieser Version steht "expressis verbis", dass dieser Test eingesetzt wird, um die Eignung des chromatographischen Systems für die konkrete Methode zu testen. Hardware, Elektronik, Methode und Proben bilden ein integriertes System, das als Ganzes evaluiert werden sollte. Somit wird klar, dass eine SST-Lösung die "Probe" enthalten sollte: Eine Lösung also, die bezüglich Konstitution den zu analysierenden Proben entspricht - keine Standardlösung (Details: siehe HPLC-Tipp im April). Für alle Komponenten, die in der SST-Lösung enthalten sind, müssen entsprechende Standards vorhanden sein.
• Bei Gehaltsbestimmungen werden Angaben zu der erlaubten relativen Standardabweichung (Variationskoeffizient) unter Wiederholbedingungen gemacht und zwar abhängig von der Anzahl der Messungen und dem spezifizierten Gehalt ("B": obere Spezifikationsgrenze - 100 %).

So sollte beispielsweise bei einem spezifizierten Gehalt von 98...102 % und drei unabhängigen Messungen (nicht drei Injektionen aus einem Vial!) der VK 0,41, bei 97...103 % und fünf Messwerten 1,10 nicht überschreiten.
• Wie in der alten wird auch in der neuen Version darauf hingewiesen, dass manchmal "Adjustments" (Justierungen, Anpassungen) notwendig sind - merke: Nicht lediglich erlaubt, sondern notwendig (nicht "allowed", sondern "necessary" (!)), falls die SST-Anforderungen nicht erfüllt werden können. Diese ist auch die einzige, aber eminente Voraussetzung für erlaubte Anpassungen bei einem SST: Die Kriterien des SST, die für die Monographie-Methode formuliert worden sind, müssen auch nach einer etwaigen Anpassung erfüllt sein. Bevor wir zu den Anpassungen kommen, zunächst das, was nicht geändert werden darf: Die Wellenlänge beim UV/VIS-Detektor. Vielmehr muss sichergestellt sein, dass der absolute Fehler bei der Einstellung der Wellenlänge ±3 nm nicht überschreitet. Anpassungen, die sowohl für isokratische als auch für Gradiententrennungen erlaubt sind, betreffen folgende Parameter: pH-Wert, Pufferstärke, Injektionsvolumen, Temperatur, stationäre Phase, Eluentenzusammensetzung. Im Einzelnen:

– pH-Wert der wässrigen Phase: Anpassung, ±0,2 pH-Einheiten.

– Pufferstärke: Nach einer eventuellen pH-Wert-Anpassung, ±10 %.

– Injektionsvolumen: Solange Präzision und Nachweisgrenze den Akzeptanzkriterien genügen, kann das Injektionsvolumen verändert werden, eine Zahlenangabe wird hier nicht gemacht.

– Säulentemperatur: ±10 %.

– Stationäre Phase: Ein Wechsel zu einem anderen Füllmaterial ist erlaubt, solange man ein Material aus der gleichen Säulenkategorie (z.B. „L1“) mit der gleichen „Chemie“ verwendet („remaining same chemistry“). Da in der USP z.B. „C18“ als eine Art „Chemie“ angesehen wird, kann eine völlig andere C18-Säule eingesetzt werden, um die SST-Kriterien zu erfüllen.

– Eluentenzusammensetzung: Neu ist, dass auch bei Gradiententrennungen die Eluentenzusammensetzung geändert werden darf. Es wird lediglich darauf hingewiesen, dass derartige Änderungen die Selektivität beeinflussen können und somit solche mit Bedacht durchzuführen sind. Daher werden bei Bedarf für Gradiententrennungen folgende Änderungen vorgeschlagen: Füllmaterial (siehe weiter oben), Dauer der isokratischen Stufe zu Beginn des Gradienten sowie Verweilvolumen („dwell volume“ – und somit auch die Mischkammer). Nun zu den erlaubten Anpassungen: Für Bestandteile der mobilen Phase unter 50 %: ±30 % relativ. Die Änderung für jede Komponente darf jedoch 10 % absolut (bezogen auf 100 % der mobilen Phase) nicht überschreiten. Folgende drei Beispiele aus dem Kapitel 621 in der USP erläutern dies: Eluentenzusammensetzung, 50 : 50; 30 % von 50 ist 15 % absolut, aber dies ist mehr als die erlaubten 10 % absolut für jede Komponente. Somit erlaubte Anpassung hier: Von 40 : 60 bis 60 : 40. Eluentenzusammensetzung, 98 : 2; 30 % von 2 ist 0,6 % absolut, somit erlaubte Anpassung hier: Von 98,6 : 1,4 bis 97,4 : 2,6. Eluentenzusammensetzung eines ternären Gemisches, 60 : 35 : 5; 30 % der zweiten Komponente (35 %) ist 10,5 % absolut – also mehr als die erlaubten 10 %. Daher darf diese Komponente „nur“ zwischen 25…45 % (35 ±10 % absolut) variiert werden. Für die dritte Komponente entsprechen 30 %, 1,5 % absolut. Somit genügen hier folgende Anpassungen den Anforderungen: Von 50 : 45 : 5 bis 70 : 25 : 5 oder von 58,5 : 35 : 6,5 bis 61,5 : 35 :3,5.

Änderungen betreffend Flussrate, Länge, Innendurchmesser und Teilchengröße gelten nur für isokratische Trennungen. Im Einzelnen:

– Flussrate: Hier gelten zwei Regelungen: Entweder ±50 % oder aber eine Flussänderung, die einer vorgenommenen Änderung der Säulenlänge, des Innendurchmessers und der Teilchengröße angepasst ist (siehe weiter unten).

– Säulenlänge und/oder Teilchengröße: Sie können so geändert werden, dass der neue Quotient Säulenlänge/Teilchengröße einen Wert zwischen -25 % und 50 % des Wertes beim ursprünglichen Quotienten entspricht. Alternative Regelung: Durch den neuen Quotienten sollte sich eine theor. Bodenzahl N ergeben, die einen Wert zwischen -25 % und 50 % der Bodenzahl einnimmt, die sich beim ursprünglichen Quotienten ergeben hatte.

– Teilchengröße und Fluss: Wenn die Teilchengröße geändert wird, muss der Fluss angepasst werden. Mithilfe folgender Formel kann der neue Fluss bei einer Änderung des Innendurchmessers und der Partikelgröße berechnet werden:

F2 = F1 × [(dc22 × dp1)/(dc12 × dp2)]

F2: Neuer Fluss, F1: ursprünglicher Fluss, dc2: Innendurchmesser der neuen Säule, dc1: Innendurchmesser der ursprünglichen Säule, dp1: ursprüngliche Teilchengröße, dp2: neue Teilchengröße.

– Teilchengröße: Wenn die ursprüngliche Teilchengröße ≥3 µm betrug und die neue ≤3 µm beträgt, muss der Fluss so angepasst werden, dass die Bodenzahl nicht mehr als 20 % abnimmt.

Tabelle 1 entstammt dem Kapitel 621 in der USP und enthält mehrere Kombinationen Säulenlänge, Teilchengröße und Fluss. Bei gleicher Effizienz (Bodenzahl, N), ergeben sich unterschiedliche Werte für Druck und Retentionszeit. So kann beispielsweise eine 150 mm x 4,6 mm x 5-µm-Säule, die bei einem Fluss von 1,5 ml/min betrieben wird, durch eine 75 mm x 2,1 mm x 2,5-µm-Säule ersetzt werden, der neue Fluss beträgt jetzt 0,6 ml/min. (Bemerkung: In der Original-Tabelle in der USP sind zwei Schreibfehler enthalten: In der dritten Zeile von unten stehen beim Fluss („F“) 0,4 und bei „Run Time“ 0,3 – ich habe in Tabelle 1 die richtigen Zahlen eingesetzt.) Eine Alternative wäre z.B. die etwas robusteren 3-µm-Teilchen zu verwenden: Es ergibt sich statt einer Bodenzahl von 9000 eine von 7500. Diese Zahl ist nicht kleiner als die erlaubten 20 %, somit wäre auch diese Änderung mit den USP-Vorgaben konform.

Vorsäule

Auch wenn in einer Monographie-Methode keine Vorsäule angegeben wird, ist die Verwendung einer solchen unter folgenden zwei Bedingungen erlaubt:

1. Länge: Vorsäule nicht länger als 15 % der analytischen Säule.

2. „same bonded phase (e.g., C18)”; In dieser Leseart bedeutet es, dass ein anderes C18-Füllmaterial als in der analytischen Säule enthalten ist bzw. verwendet werden darf.

Bedingung ist lediglich, dass die Anforderungen an den Systemeignungstest (SST), wie sie für die Originalmethode formuliert worden sind, weiterhin erfüllt werden.

Kommentare

Es folgt nun eine Kommentierung einiger Hinweise im Kapitel 621 in der USP. Es folgen zunächst Hinweise/Angaben, die ich persönlich als problematisch bzw. als unglücklich erachte. Anschließend gehe ich auf Punkte ein, die ich richtig und hilfreich finde.

A. Nicht 100 % geglückte Textpassagen/Empfehlungen:
1. In diesem Kapitel ist einmal die Rede von „Relative Retention (r)“ und einmal von „Relative Retention Time (RRT)“ (unadjusted relative retention). Im ersten Fall handelt es sich um den Quotienten aus zwei Retentionszeiten, normiert um die Totzeit tM, r = tR2 - tM/tR1 – tM. Im zweiten Fall lediglich um den Quotienten aus zwei Retentionszeiten RRT = tR2/tR1 . Und etwas weiter im Text steht: „Comparisons in USP are normally made in terms of unadjusted relative retention.” Nun, letzteres ist ein sehr strenges Kriterium, seine Einhaltung bedarf der Konstanz aller chromatographischen und apparativen Parameter. Sollte der Quotient sich beispielsweise im Routinebetrieb geändert haben, ist zunächst nicht ersichtlich, woran es liegt. Der Retentionsfaktor, k, ((tr – tM)/tM) wäre als Kriterium unter Umständen sinnvoller, denn er erlaubt die Zuordung eines Peaks (z.B. Peak Nr. 4 ist Substanz x) auch dann, wenn die Packungsdichte einer neuen Säule oder ihr Innendurchmesser von der zuletzt Verwendeten sich etwas unterscheidet – vorausgesetzt die „Chemie“ (Eluent, stationäre Phase, Temperatur) ist konstant geblieben.

2. Bei der Beschreibung des SST steht: „The signal-to-noise ratio (S/N) is a useful system suitability parameter. The S/N is calculated as follows: S/N = 2H/h”. Dieses lapidare Statement ohne weitere Hinweise empfinde ich als äußerst problematisch: So fehlt mindestens folgender Hinweis: Ein Peak-Rauschen-Verhältnis von 2 : 1 ist unter realen Bedingungen schwer zu reproduzieren, denn dieses Verhältnis ist von der täglichen „Form“ aller Beteiligten abhängig: Energie der Lampe (beim UV-Detektor), Ablagerungen am Interface (LC/MS-Kopplung), Reinheit des Eluenten usw., usw. Sollte das S/N-Verhältnis zur Bestimmung der Nachweisgrenze dienen, ergeben sich größere Probleme, auf die ich hier nicht eingehen kann.

3. Etwas weiter steht: „Adjustments to the composition of the mobile phase in gradient elution may cause changes in selectivity and should be made with caution.” Die Aussage als solche ist zwar richtig, dennoch wird suggeriert, dass bei isokratischen Trennungen eine „Anpassung” der mobilen Phase nicht zu einer Änderung der Selektivität führen kann.

4. Ich sehe keinen Grund dafür, dass bei isokratischen Trennungen Änderungen der Säulenparameter unter bestimmten Voraussetzungen erlaubt sind (siehe weiter oben), bei Gradienten jedoch nicht: „For gradient separations, changes in length, column inner diameter and particle size are not allowed.“
5. Die Aussage „…peak areas and peak heights are usually proportional to the quantity of compound eluting” ist nur für massenempfindliche Detektoren wie dem Massenspektrometer richtig. Es sollte stehen „…to the quantity or to the concentration…“, in diesem Fall sind auch konzentrationsempfindliche Detektoren wie UV eingeschlossen. Da weiter oben im Text bei den Anpassungen auch der Fluss mit ±50 % erwähnt wird, sollte der Leser als Erinnerung den Hinweis erhalten, dass bei einer Erhöhung der Flussrate um 50 % die Fläche im Falle beispielsweise eines DAD um 50 % reduziert wird, was im Spurenbereich durchaus zu Problemen führen kann.

B. Gute und hilfreiche Textpassagen:
1. Der Hinweis „Peak areas are generally used, but may be less accurate if peak interference occurs” ist sehr erfreulich. Ich hätte mir allerdings gewünscht, dass hier über diese richtige Aussage hinaus die Empfehlung folgt, in solchen und weiteren problematischen Fällen über die Peakhöhe auszuwerten ist.

2. Im Falle von asymmetrischen Peaks heißt es: „As peak symmetry moves away from values of 1, integration, and hence precision, become less reliable.” Das ist ein richtiger und wichtiger Hinweis: Nicht nur die Integration, üblicherweise über die Peakfläche, ist bei asymmetrischen Peaks falsch, auch die Präzision (letzten Endes der Variationskoeffizient Vk) ist abhängig vom Tailing: Wenn ein vorgegebener Vk nicht erreicht werden kann, wird im Alltag nicht immer an eine mangelnde Peaksymmetrie als mögliche Ursache gedacht.

3. Auch folgenden Hinweis finde ich positiv: „Integrate the peak area of any impurity that is not completely separated from the principal peak, preferably by valley-to-valley extrapolation (tangential skim).” Wenn ein kleiner Peak an der Flanke eines großen Peaks eluiert, und es soll doch über die Peakfläche und nicht über die Peakhöhe ausgewertet werden, ist in der Tat „tangential skim“ das kleinere Übel. Die Erfahrung zeigt, dass dies für alle Peaks kleiner ca. 5 % des Hauptpeaks der Fall ist und sollte eher als die Lotfällung benutzt werden.

4. Im Falle von Reinheits-Methoden steht: „The standard may be the drug itself at a level corresponding to, for example, 0.5 % impurity, assuming similar peak responses. When impurities must be determined with greater certainty, use a standard of the impurity itself or apply a correction factor based on the response of the impurity relative to that of the main component.” Obwohl in der Praxis häufig gleicher Responsefaktor zwischen Hauptpeak und Verunreinigung stillschweigend angenommen und der Einfachheit halber auf diese Weise quantifiziert wird, sollte man sich zumindestens in kritischen Fällen diesbezüglich schon Gedanken machen…

5. Im Text wird zwar ausführlich auf die Bodenzahl N (Effizienz) eingegangen, so z.B. wie Länge, Fluss, Teilchengröße zu ändern sind, dass die Bodenzahl konstant bleibt. Nichtsdestotrotz fällt folgender Hinweis positiv auf: „This is a less reliable means to ensure resolution than is direct measurement. Column efficiency is, in part, a reflection of peak sharpness, which is important for the detection of trace components.” Also: In der Chromatographie ist – wenn es um eine Trennung geht – die Auflösung, R, das Wichtigste. Die Bodenzahl, und damit verbunden die Peakform, ist schon ein wichtiger Faktor, der allerdings lediglich im Spurenbereich (gutes Peak-Rauschen-Verhältnis!) eine Relevanz hat.

6. Bezüglich Retentionszeit steht: „tR may be used as a parameter for identification. Chromatographic retention times are characteristic of the compounds they represent but are not unique. Coincidence of retention times of a sample and a reference substance can be used as a partial criterion in construction of an identity profile but may not be sufficient on its own to establish identity. Absolute retention times of a given compound may vary from one chromatogram to the next.” Hier ist also der richtige und klare Hinweis: Die Übereinstimmung der Retentionszeit von Substanz und Referenz kann bestenfalls ein „partial criterion” zur Identifizierung dieser Substanz sein.


Das Fazit

Eine wesentliche Änderung der Revision betrifft Gradiententrennungen, ab jetzt sind auch hier Anpassungen erlaubt. Desweiteren wird darauf verzichtet, Zahlenangaben zur erlaubten Änderungen bezüglich Säulenlänge und Teilchengröße zu machen. Vielmehr steht eine Größe im Fokus, die mit diesen zwei chromatographischen Parametern zusammenhängt: die Bodenzahl. Nur jene muss weiterhin erreicht werden; die dafür notwendige Säulenlänge und/oder Teilchengröße ergibt sich zwangsläufig.

Indirekt macht die USP aber auch klar, dass die Bodenzahl eigentlich gar nicht so wichtig ist und denkt dabei an die Problematik des Totvolumens der Anlage im Falle von kleinen Teilchen. So ist beispielsweise bei ≤3-µm-Teilchen eine Abnahme von 20 % zulässig. In der Tat wird die Auflösung nicht so stark von der Bodenzahl beeinflusst. Die insgesamt großzügigen Anpassungen, die erlaubt sind, waren und bleiben weiterhin ein Charakteristikum dieses USP-Kapitels. Alles in allem ist der Text in diesem Kapitel der USP durchaus pragmatisch, lässt den Anwendern große Spielräume und enthält viele, gute Hinweise.

Das Festhalten an Kriterien aus der Tradition heraus, wie S/N von 2, entspricht zwar nicht dem Selbstverständnis der Analytik von heute, sollte aber nicht überbewertet werden und das positive Gesamt-Fazit schmälern.

Es ist schon sinnvoll zu versuchen, die vorgegebenen Spielräume im Alltag zu nutzen. Dabei denke ich beispielsweise an Kostenersparnis und an eine „richtigere“ Aussage, so zum Beispiel Verkürzung der Säulenlänge bei gleichzeitiger Abnahme der Korngröße oder Auswertung über die Peakhöhe im Falle von nicht-aufgelösten und/oder tailenden Peaks.

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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