HPLC-Tipp

Modernes HPLC/UHPLC gekauft, dennoch unzufrieden – warum? Teil 2

Der Fall
Im letzten Artikel haben wir uns über den Fall unterhalten, dass an einem modernen HPLC/UHPLC-Gerät Peakform, Auflösung und Empfindlichkeit im Vergleich zu einem älteren Gerät womöglich zu wünschen übrig lassen. Heute wollen wir mögliche Gründe für die zwei letztgenannten Fälle ausfindig machen.

Bild: Zum Einfluss von Verweilvolumen auf die Trennung (Details siehe Text).

Die Lösung
Schlechtere Trennung an modernen Geräten:
Moderne HPLC/UHPLC-Geräte weisen im Vergleich zu älteren Geräten ein wesentlich kleineres Verweilvolumen auf, Verweilvolumen = Dwell- oder Delayvolume: Volumen von der Mischkammer/dem Mischventil bis zum Säulenkopf. Das Verweilvolumen wiederum beeinflusst beim Gradienten u.a. auch die Auflösung nach dem Motto: Δ Verweilvolumen oft Δ Auflösung. Und hier liegt der „Hund begraben“: Kleines Verweilvolumen bedeutet oft eine bessere Trennung, aber eben „oft“, keinesfalls immer. Im Bild wird gezeigt, dass an einem älteren Gerät mit einem größeren Verweilvolumen (oberes Bild) in diesem Fall die Trennung besser ist: Eine Nebenkomponente wird abgetrennt, was am modernen Gerät mit einem sehr kleinen Verweilvolumen nicht der Fall ist (unteres Bild).

Empfindlichkeitsverlust an modernen Geräten:
Ein modernes System weist neben einem kleinen Verweilvolumen, siehe oben, auch ein kleines Totvolumen auf, Totvolumen = „Extra Column Volume“: Volumen vom Autosampler bis einschließlich Detektor – ohne Säule. Mit dem Ziel, ein möglichst kleines Totvolumen zu erreichen, werden u.a. Detektorzellen mit sehr kleinen Volumina verwendet: 1…2 µl oder noch kleiner. Eine kleine (klassische) Zelle bedingt oft auch einen kurzen Lichtweg. Und laut Lambert-Beer-Gesetz hängt die Signalstärke u.a. eben auch vom Lichtweg ab. In älteren Geräten befinden sich große Zellen mit einem langen Lichtweg. Ferner werden an älteren Geräten üblicherweise nicht nur größere Injektionsvolumina injiziert, sondern oft auch recht konzentrierte Lösungen. Die höhere Konzentrationen und der längere Lichtweg könnte der Grund dafür sein, dass an älteren Geräten die Empfindlichkeit besser als an modernen Geräten ist.

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Das Fazit
Häufig gilt: Neu ist besser – aber eben nur „häufig“…

Ihr Stavros Kromidas

© by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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