Der HPLC-Tipp im April

Systemeignungstest (SST) - Design und Kriterien

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall
Zweifelsohne muss gewährleistet sein, dass eine HPLC-Anlage technisch „in Ordnung“ ist, der Beweis ist in regelmäßigen Abständen zu erbringen. Dennoch drängt oft die Zeit, häufige/unnötige Überprüfungen sind kontraproduktiv. Es ist nun so, dass in stark reglementierten Bereichen das „wie“ und „wie oft“ mehr oder weniger vorgegeben sind, eine Änderung der Ist-Praxis ist de facto kaum möglich. In anderen Bereichen allerdings sind Spielräume vorhanden; sinnvolle, effektive Überprüfungen sind realisierbar. Nachfolgend werde ich versuchen darzustellen, welche Tests aus analytischer Sicht Sinn machen und welche Kriterien für welche Fragestellung gelten könnten.

Die Lösung
Halten wir zunächst Folgendes fest: Es gibt den Geräte- oder Systemtest und den Sys- temeignungstest („System Suitability“ Test, SST). Beim Gerätetest wird – wie der Name auch verrät – das Gerät überprüft. Der Sinn beim SST ist zu überprüfen, ob diese Methode an diesem Gerät hier und jetzt funktioniert. Da es beim Gerätetest um die Überprüfung der Funktionalität des Gerätes geht, sollte bei diesem Test das Gerät selbst nahezu die einzige Variable sein. D.h., der Part „Chromatographie“ muss hier einfach und robust sein, er sollte keine Fehlerquelle darstellen.

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Dazu bedient man sich eines chromatographisch leicht durchzuführenden Tests (keine schwierige Trennung, keine sehr niedrige Wellenlänge, keine ölige Matrix, usw.). Man verwendet also letzten Endes eine einfache Standardlösung, so dass bei nicht akzeptablen Ergebnissen wie z.B. Verschiebung der Retentionszeit, mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakflächen, starkes Tailing, etc. das Problem dem Gerät/der Säule zugeordnet werden kann.

Beim SST geht es um eine konkrete Methode. Und weil ja gleich nach dem SST reale Proben und keine Standards gemessen werden, sollte für einen SST eine reale Probe benutzt werden. D.h. eine Lösung, die bzgl. Matrix, Anzahl und Konzentration der Komponenten usw. völlig oder möglichst nahe den anschließend zu vermessenden Proben entspricht. Die häufige Praxis, eine Standardlösung für einen SST zu verwenden, kann sich als problematisch erweisen, denn: Es kann ja sein, dass das Gerät in Ordnung ist, dass aber Bestandteile der realen Probe, die in der Standardlösung fehlen, das Ergebnis (UV-Absorption/Ionisation und somit Peakfläche/Empfindlichkeit, aber auch Peakform, etc.) beeinflussen können.

Dazu lediglich zwei Beispiele: Magnesiumcarbonat aus einer Tablette (reale Probe) verändert ein wenig den pH-Wert der Probenlösung, die Standardlösung, die nur den Wirkstoff enthält, weist einen anderen pH-Wert auf. Oder: Ein hochmolekularer Bestandteil der Matrix in der Probe beeinflusst geringfügig die Peakform des Analyten und bei unveränderten Integrationsparametern wird etwas anders integriert. In beiden Fällen können sich unterschiedliche Peakflächen des Analyten in der Proben- und in der Standardlösung ergeben – trotz gleicher Konzentration/Masse. Dieser systematische Fehler wird nicht immer erkannt… Für einen SST kann nur dann eine Standardlösung verwendet werden, wenn im Rahmen der Validierung bewiesen worden ist, dass die Matrix das Ergebnis keinerlei beeinflusst.

Nun zu den Kriterien eines SST. (Bemerkung: Die weiter unten vorgeschlagenen Kriterien können analog auch für Methodentransfers herangezogen werden.)

Bei einer HPLC-Methode haben wir in der Regel folgende drei Zielsetzungen: Wir wollen „gut“ trennen (ausreichende Auflösung), wir wollen den Gehalt bestimmen (zuverlässige Ermittlung der Peakfläche), und wir wollen möglichst empfindlich messen (niedrige Bestimmungsgrenze). Je nach Fragestellung können folgende Kriterien für einen SST herangezogen werden, wobei bei Kombinationsmethoden (z.B. Gehalt und Reinheit) natürlich zwei oder alle drei Kriterien notwendig sind:


Trennung: Auflösung (Resolution, R) >1,5 bzw. > 2.

Kurzkommentar: Man hat nur dann die Gewähr, dass der Integrationsfehler bei der automatischen Integration < 1 % beträgt, wenn R > 2 ist [1]. In schwierigen Fällen (komplexe Matrix, viele Peaks, etc.) wäre R > 1,5 sicherlich zu akzeptieren, man sollte jedoch prüfen, ob hier automatisches Integrieren richtige Ergebnisse liefert.


Gehalt: Variationskoeffizient des Gehaltes bei einer 6-fachen Bestimmung ca. 2…3 %.

Kurzkommentar: Der Gehalt sollte der Peakfläche vorgezogen werden, da letztere z.B. vom Zustand des Detektors abhängt. Wenn jedoch die Methode am selben oder an einem baugleichen Gerät gemessen wird, kann ruhig das strengere Kriterium, nämlich die Reproduzierbarkeit der Peakfläche, gelten. Reproduzierbarkeit des Gehaltes gelte dann für einen Methodentransfer.


Bestimmungsgrenze:
1. Zu ermitteln mittels der Kalibriergeraden (reale Proben!).

2. Mithilfe einer Verdünnungsreihe wird die Konzentration ermittelt, die mit einem noch akzeptablen Variationskoeffizienten gemessen werden kann.

3. Mittels des Peak/Rauschen-Verhältnisses (S/N, „Signal to Noise“), hier wird ein S/N-Verhältnis von 50:1 empfohlen.

Kurzkommentar: Das vielerorts verwendete Kriterium für die Bestimmungsgrenze von S/N 10 : 1 ist als risikobehaftet anzusehen. Es hat sich anhand zahlreicher Untersuchungen gezeigt [1], dass nur bei absolut symmetrischen Peaks, einer Basislinientrennung und einer ideal-geraden Basislinie der Integrationsfehler im Falle von S/N 10 : 1 reproduzierbar und zuverlässig < 10 % ist, vielmehr beträgt der Fehler oft 10 % und mehr. Ein Integrationsfehler von < 1 % wird bei den kommerziellen Softwareprogrammen und im Falle von „Real Life“-Trennungen ab einem S/N von ca. 50/1 oder noch sicherer ab ca. 80/1 gewährleistet.


Zwei Abschlussbemerkungen:
• Nach meinem Dafürhalten sind Bodenzahl und Tailingfaktor als Kriterien für einen SST nicht zweckdienlich, denn in der Auflösung „steckt“ ja alles drin! Und bei Spurenmethoden ist das aktuelle S/N-Verhältnis aussagekräftiger als Bodenzahlen. Es kann nichts Schlimmes z.B. mit einer Säule passieren, ohne dass ich es merke, wenn die Auflösung bzw. das S/N-Verhältnis erreicht wird, die/das ich (oder mein Chef oder mein Kunde) als Kriterium definiert habe. Und wenn die erforderliche Auflösung von z.B. 1,5 erreicht wird, ist es eigentlich zweitrangig, ob die Bodenzahl 3000 oder 2950 beträgt oder der Tailingfaktor 1,4 und eben nicht 1,3.
• Wenn der SST, der ja häufig durchgeführt wird, okay ist, kann eigentlich auf die jährliche oder noch häufiger durchgeführte Überprüfung der Anlage verzichtet werden, denn noch einmal: Es kann nichts Gravierendes mit der Anlage passieren, ohne dass ich davon Kenntnis nehme, siehe oben. Als Argument bei einer Diskussion/Inspektion kann eine Kontrollkarte dienen, die zu den genutzten Kriterien die ermittelten Daten der letzten 6 oder 12 Monate enthält. Der ISK-Zustand der Anlage („In Statistischer Kontrolle“) kann somit dokumentiert werden.

Da vermutlich auf die technische Überprüfung der Anlage nicht zu verzichten sein wird, sollte wenigstens über die Häufigkeit der Überprüfung mit Standards nachgedacht werden.


Das Fazit
Überlege zunächst, was du mit dem Gerät vorhast, und definiere dann die für diese Methode bzw. Fragestellung geeigneten/notwendigen Kriterien: Ausreichende Trennung (R), Gehaltsbestimmung (Variationskoeffizient der Peakfläche – beim Methodentransfer des Gehaltes), quantitative Bestimmung im Spurenbereich (Bestimmungsgrenze). Wenn Bestandteile der Probe das Ergebnis beeinflussen können, verwende stets eine reale Probe. Sollte dies nicht möglich/zu aufwendig sein, verwende als zweitbeste Praxis zudosierte Lösungen. Reduziere Gerätetests mit Standardlösungen auf das absolut notwendig vertretbare Minimum.


[1] H.J. Kuss, S. Kromidas (Eds.) „Quantification in LC and GC – A practical guide to Good Chromatographic Data“, Wiley-VCH, 2009, ISBN978-3-527-32301-2.

© by Stavros Kromidas

www.kromidas.de

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