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Micro-Array-HandlingNOC-PCR + Echtzeitdetektion

Vervielfältigung von Gensequenzen mit Echtzeitdetektion
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Micro-Array-Handling: NOC-PCR +  Echtzeitdetektion
Einen neuartigen Probenträger, ein Echtzeit-Detektionsverfahren und das entsprechende Laborgerät für ein neuartiges PCR-Verfahren entwickelten Wissenschaftler des Fraunhofer IPA im Rahmen eines vom BMBF geförderten Kooperationsprojekts. Das Array-basierte PCR-Verfahren weist gegenüber etablierten Verfahren eine 100- bis 10000-fach höhere Aussagekraft auf.

Gegenwärtige Entwicklungen auf dem PCR-Markt zielen auf schnellere Analysen, niedrigere Probenvolumina (Kosten) und bessere Automatisierbarkeit ab, stoßen aber zumindest hinsichtlich der Zeit und der Volumina an physikalische Grenzen, weshalb bei ihrer Effizienz keine großen Steigerungen zu erwarten sind.

Etablierte Echtzeit-PCR-Verfahren können in einer 25-µl-Probe die Ausgangskopienzahl von ein bis sechs DNA-Bruchstücken (oder Gensequenzen) bestimmen. Das patentierte Nested-on-Chip-PCR-Verfahren (NOC-PCR-Verfahren), bei dem die 25-µl-Probe über einen Micro-Array mit bis zu 10000 Punkten pipettiert wird, kann durch die so gewonnene Ortsauflösung die DNA-Probe auf bis zu 10000 Eigenschaften oder Gensequenzen untersuchen. Leider ist hierbei bisher keine Beobachtung in Echtzeit und damit keine Bestimmung der Ausgangskopienzahl, sondern nur eine binäre Aussage, d.h. ob eine Gensequenz in der Probe vorhanden ist oder nicht, möglich gewesen.

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Ziel des Projekts war es also, das existierende und äußerst vielversprechende NOC-PCR-Verfahren um eine Echtzeitdetektion zu erweitern. Dieses Ziel wurde von den Projektpartnern Baden Biotech, Clemens GmbH, Boehringer Ingelheim MicroParts, Congen Biotechnologie GmbH und dem Fraunhofer IPA verfolgt. Das Fraunhofer IPA zeichnete hierbei für die Entwicklung des Probenträgers, der optischen Detektionseinheit und die Gesamtintegration verantwortlich.

Eine besondere Schwierigkeit bei der Entwicklung bereitete das Detektionsverfahren. Bei der hier gegebenen Anordnung von gedruckten Punkten und der flüssigen Probe darüber konnten die üblichen Verfahren nicht eingesetzt werden. Denn die flüssige Probe oder der Überstand enthalten dieselben durch Laser anregbare Leuchtmoleküle, sogenannte Fluorophore, wie die nachzuweisenden, an die gedruckten Punkte gebundenen Reaktionsprodukte. So sind Reaktionsprodukte und Ausgangsstoffe nicht voneinander zu unterscheiden, entsprechend ist auch keine Analyse möglich.

Bis zu zehntausend Ausgangskopien

In einem ersten Schritt haben die Forscher des Fraunhofer IPA verhindert, dass das Laserlicht in den Überstand eindringt und so die Flüssigkeit zum Leuchten anregt. Aufgrund eines physikalischen Phänomens ist die Strahlung in einer ganz dünnen, ca. 500 Milliardstel Meter dicken Schicht noch immer stark genug, um die Fluorophore anzuregen. So wird sichergestellt, dass nur die Reaktionsprodukte in den Punkten, nicht aber die Flüssigkeit darüber leuchten. Die Leuchtintensität in den einzelnen Punkten hängt nun davon ab, wie viele passende Gensequenzen in der Probe waren und wie oft diese vervielfältigt wurden.

Aus der zeitabhängigen Fluoreszenz der einzelnen Punkte, die mit einem Kamerasystem gemessen wird, kann dann auf die Ausgangskopienzahl von bis zu 10 000 Gensequenzen in einer einzigen 25-µl-Probe geschlossen werden.

Im Projekt wurden ein für diese Anordnung und diese Messmethode ausgelegter Probenträger oder Chip, eine optische Detektionseinheit und der dafür geeignete PCR-Cycler und die entsprechende Steuer- und Auswertesoftware entwickelt. In einem nächsten Schritt werden Gerät und Verfahren am Fraunhofer IPA optimiert und auf ihre Leistungsfähigkeit untersucht.

Ansprechpartner für weitere Informationen: Fraunhofer-Institut für Produktionstechnik und Automatisierung IPA, Dipl.-Phys. Axel Wechsler, E-Mail: axel.wechsler@ipa.fraunhofer.de.

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