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Automatisierung in den Life Sciences

High-Speed-Mikroskopie – Mikroskopieren in Bewegung

Mit einer schnellen Digitalisierung der Proben und einer parallel stattfindenden Bildauswertung kann automatisierte Mikroskopie für Analytik und Qualitätskontrollen beschleunigt und effizienter werden. Moderne High-Speed-Mikroskope, über welche die Autoren hier berichten, vereinen hohe Aufnahmegeschwindigkeiten mit intelligenter Software für individuelle Auswertungen.

Automatisierte Überwachung einer Zellkultur durch High-Speed-Mikroskopie mit einer Augmented-Reality-Benutzeroberfläche. © Fraunhofer IP

Die Mikroskopie ist eines der wichtigsten Verfahren, um qualitative Aussagen über den Zustand von Zellen zu treffen. Bei der Herstellung zahlreicher zellbasierter Produkte sind einfache Stichprobenmessungen nicht mehr ausreichend, so dass große Flächen wie ganze Multiwell-Platten hinsichtlich mikroskopischer Details untersucht werden müssen. Auch in Laboren, in denen im Hochdurchsatz Proben analysiert werden müssen, ist die Mikroskopie oft ein limitierender Faktor. Bei der Beschleunigung und Automatisierung dieser Prozesse stößt man mit einfachen Mikroskopen schnell an Grenzen. Bei manuellen Mikroskopen muss für jede einzelne Aufnahme der Probentisch neu positioniert und fokussiert werden. Auf dem Markt verfügbare automatisierbare Mikroskope können diese Prozesse im „Stop-and-Go“-Betrieb bereits automatisch ausführen. Dennoch dauert der Aufnahmeprozess lange und die Auswertung findet meistens manuell statt, wodurch es leicht zu Anwenderfehlern kommen kann. Um dieser Problematik entgegenzuwirken, entwickeln Forschende am Fraunhofer IPT High-Speed-Mikroskope (HSM), mit denen große Flächen in hoher Auflösung äußerst schnell digitalisiert werden können. Zusammen mit intelligenter Bildauswertungssoftware können diese Systeme vollautomatisierte 100%-Qualitätskontrollen im Hochdurchsatz durchführen. Dabei ist die HSM-Technologie nicht auf einfache Hellfeld- und Dunkelfeldaufnahmen beschränkt, sondern ist auch für die Phasenkontrast- und Fluoreszenzmikroskopie anwendbar. Zusätzlich ist eine anwendungsspezifische Bildauswertung in Echtzeit möglich.

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Die HSM-Technologie

Im Gegensatz zum „Stop-and-Go“-Betrieb herkömmlicher Mikroskope scannt ein HSM die Probe in der Bewegung und erzielt somit einen signifikanten Geschwindigkeitsvorteil. Das Aufnehmen mikroskopischer Bilder während der Bewegung war aufgrund der fehlenden Fokusnachführung lange nicht möglich. Herkömmliche Aufnahmesysteme mit einem Software-Autofokus nehmen an derselben Stelle mehrere Bilder in unterschiedlichen Fokuslagen auf und erstellen so für jeden Bereich ein sog. Z-Stack, woraus dann das schärfste Bild ermittelt wird. Diese Fokuslage wird dann für den weiteren Scan verwendet. Ändert sich die Fokuslage, muss der Vorgang wiederholt werden. Man mag denken, dass bei einem flachen Objekt, wie zum Beispiel bei einer Wellplate, die Fokuslage nur einmalig eingestellt werden müsste. Dies ist jedoch nicht der Fall, da bereits kleinste Ungleichmäßigkeiten in der Dicke des Objektträgers, wie es bei herkömmlichen, durch Spritzguss hergestellten Wellplates der Fall ist, zu einer Verschiebung der Fokuslage führen und kein scharfes Bild mehr aufgenommen wird. Deshalb muss der Fokuspunkt regelmäßig neu ermittelt werden. Diese Prozedur kostet Zeit und verlangsamt den gesamten Prozess.

HSM in einem vollautomatisierten Workflow mit Beladung durch einen Roboter. © Fraunhofer IPT

Um diese Herausforderung zu lösen, wurde ein Hardware-Autofokussystem entwickelt, welches in der Lage ist, die Z-Position der Probenoberfläche sowie des Probenuntergrunds (z. B. die obere Seite des Wellplate-Bodens) hochpräzise zu ermitteln und so den Fokuspunkt vorab zu bestimmen. Dazu werden konfokal-chromatische Sensoren oder optische Kohärenztomographie (OCT) verwendet. In einem separaten Schritt vor der Bildaufnahme werden mit sehr hoher Geschwindigkeit mehrere tausend Punkte abgetastet. Anschließend werden die Fokuslagen für jedes einzelne Bild berechnet. Bei der anschließenden Bildaufnahme kann die Fokuslage dann über schnelle und hochpräzise Piezoachsen nachgeführt werden. So wird eine kontinuierlich scharfe Fokussierung des bewegten Objekts erreicht. Mit der Technik ist es ebenfalls möglich, vor der Bildaufnahme von der gesamten Probe ein Höhenprofil zu erstellen sowie Schichtdicken zu messen.

Automatische Segmentierung von Zellkulturaufnahmen mittels DL-Modell. © Fraunhofer IPT

Nicht nur das Hardware-Autofokussystem allein ermöglicht die hohe Geschwindigkeit des HSM. Für den Aufbau eines HSM sind folgende Hauptkomponenten notwendig: eine Hochgeschwindigkeitskamera, eine synchronisierte Kurzpulsbelichtung mittels LED, hochpräzise Achsen für die Positionierung der Proben bzw. der Optik sowie entsprechende Kontroller für die synchrone Ansteuerung. Als Basis kann für die High-Speed-Mikroskopie ein herkömmliches Mikroskop mit den entsprechenden Schnittstellen dienen. Hersteller wie u. a. Nikon, Olympus, Leica oder Zeiss bieten Mikroskop-Modelle an, die sich zu einem HSM aufrüsten lassen. Dabei können bestehende Objektive weiterverwendet werden. Wenn man also bereits ein Mikroskop verwendet, dies aber dem steigenden Durchsatzbedarf nicht gerecht wird, ist es nicht zwangsläufig notwendig, sich ein vollständiges High-Speed-Mikroskop neu zu kaufen. Am Fraunhofer IPT wurden Lösungen entwickelt, um bestehende individuelle Mikroskopie-Workflows durch eine HSM-Erweiterung zu optimieren und zu beschleunigen. Im Vergleich zu herkömmlichen automatisierten Mikroskopen scannt ein HSM eine Probe bis zu 32-mal schneller. Letztendlich lässt sich so eine Multiwell-Platte mit einem 10 x-Objektiv und einer Auflösung von 0,65 µm/px in ca. einer Minute vollständig digitalisieren. Die Charité in Berlin organisiert regelmäßig den International Scanner Contest (ISC), wo Mikroskopiesysteme verschiedener Hersteller verglichen und nach unterschiedlichen Kriterien, wie z. B. der Scan-Geschwindigkeit, bewertet werden. Der Gewinner des letzten ISC erreichte mit einem 20 x-Objektiv eine Geschwindigkeit von 0,86 cm²/min. Ein HSM kann mit demselben Objektiv für das Scannen desselben Objektträgers eine Aufnahmegeschwindigkeit von 7,84 cm²/min erreichen. Dies ist 9-mal schneller als der erstplatzierte Slide-Scanner. Durch die nächste Generation an High-Speed-Mikroskopen, welche sich momentan in der Entwicklung befinden, soll diese Geschwindigkeit noch einmal um den Faktor 10 erhöht werden. [1]

Automatisierte Bildverarbeitung und -auswertung

Letztendlich ist jedoch nicht nur die Geschwindigkeit der Aufnahme entscheidend, sondern auch deren Qualität. Die aufgenommenen Rohdaten sind je nach Probe und Mikroskopiemodus nur mehr oder weniger gut verwendbar. Oft ist eine Bearbeitung der aufgenommenen Bilder sinnvoll. Damit der gewonnene Geschwindigkeitsvorteil des HSM an dieser Stelle nicht verloren geht, muss diese Datenverarbeitung in mindestens genau so hoher Geschwindigkeit ablaufen. Dies wird durch intelligente Algorithmen und entsprechende GPU-Unterstützung realisiert. Ein wichtiger Bestandteil der Bildvorverarbeitung ist die Schattierungskorrektur. Bei der Aufnahme der einzelnen Bilder entstehen an den Rändern aufgrund von Beleuchtungsinhomogenitäten Vignetteneffekte. Um dies zu kompensieren, wird Pixel für Pixel, je nach Intensität und Position im Bild, ein Korrekturwert errechnet, wodurch der Störeffekt vollständig entfernt wird. Das HSM nimmt – je nach Probengröße und Objektiv – tausende Einzelbilder auf, die alle nur ein kleines Sichtfeld abdecken. Doch da letztendlich ein großes zusammenhängendes Bild gewünscht ist, werden die Einzelbilder mit einem Stitching-Algorithmus übergangsfrei zusammengefügt, so dass ein einzelnes äußerst hochaufgelöstes Bild entsteht. Zudem wird abhängig vom Anwendungsfall der Kontrast des Bildes durch eine sog. Histogramm-Normalisierung erhöht.

Gesamtbild einer Well (A), vergrößerter Ausschnitt der Aufnahme (B), Segmentierung des Bildes (C), vergrößerter Ausschnitt des segmentierten Bildes (D). © Fraunhofer IPT

Die Entwickler am Fraunhofer IPT sind noch einen Schritt weiter gegangen und haben neben der Bildverarbeitung auch die Bildauswertung automatisiert. Hierbei sind nicht nur Standardanalysen wie z. B. die Bestimmung von Anzahl, Position und Größe von Zellkolonien in einer Zellkultur möglich, sondern auch komplexere Auswertungen, wie die Bestimmung der Viabilität. Durch die Integration von Software, die auf künstlicher Intelligenz basiert, ergeben sich nahezu „grenzenlose“ Möglichkeiten der automatisierten Bildauswertung. Unter anderem wurde ein Deep-Learning (DL)-Algorithmus entwickelt, der die HSM-Aufnahmen einer Zellkultur mit induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) in Echtzeit klassifizieren und analysieren kann. Auf Basis annotierter Trainingsdaten wurde ein neuronales Netzwerk trainiert, welches in der Lage ist, jeden Bildpunkt einer bestimmten Klasse zuzuordnen und somit eine Segmentierung zu ermöglichen. Hierbei wird zwischen iPSCs, differenzierten Zellen, toten Zellen und Hintergrund unterschieden und diese entsprechend markiert. Somit können Kolonien identifiziert und anhand von Parametern bewertet werden. Diese sind beispielsweise Größe, Lage, Reinheit, Umfang und Rundheit. Auch Werte, die die gesamte Kultur betreffen, wie zum Beispiel die besiedelten Flächenanteile pro Klasse, werden vollautomatisch bestimmt. Bei der Analyse wird anhand der ermittelten Parameter automatisch entschieden, wie der Zellkulturprozess abgeändert oder weitergeführt werden muss. Es konnte bereits nachgewiesen werden, dass das DL-Modell bei der Klassifizierung der Bilder akkuratere Ergebnisse liefern kann als erfahrenes Fachpersonal, welches die Klassifizierung manuell durchführt. Zusammen mit dem Geschwindigkeitsvorteil, der mit der DL-basierten Auswertung einhergeht, ist dessen Überlegenheit bezüglich Effizienz und Qualität sehr deutlich. Grundsätzlich würden sich alle Prozesse der biologischen Bildauswertung, die manuell von Experten und Expertinnen auswertbar sind, auch mit einem trainierten DL-Modell auswerten lassen. Mit voranschreitender Automatisierung und Digitalisierung, auch in den Bereichen der biologischen Produktion und der Laboratoriumsmedizin, wird erwartet, dass in Zukunft dem biologischen Fachpersonal deutlich mehr Arbeit abgenommen werden kann und Produktivität sowie Prozesssicherheit mittels HSM und DL-Auswertung signifikant gesteigert wird. [2]

Anwendungsmöglichkeiten

HSM im Einsatz in der StemCellFactory für die automatisierte iPSC-Produktion. © Fraunhofer IPT

Bislang konnte sich das HSM bereits in mehreren Bereichen als sinnvolles Werkzeug für die Bilderfassung und -verarbeitung etablieren. Nicht nur rein biologische Anwendungen sind hier zu nennen. Auch in der Qualitätskontrolle bei der Produktion von Mikroelektronik oder anderen mikroskopisch kleinen Bauteilen, wie zum Beispiel bei Schwingquarzen für Uhren, liefert das HSM einen Mehrwert. Ein großes Anwendungsgebiet ist jedoch in den Lebenswissenschaften, sei es bei der Produktion in großen Pharmaunternehmen oder in Laboren für die Analytik im Hochdurchsatz. Ein spannendes Feld, in dem das HSM Anwendung findet, ist bei der Herstellung von ATMP. ATMP steht für Advanced Therapy Medicinal Products und umfasst Arzneimittel für die Zell- und Gentherapie sowie Tissue-Engineering-Erzeugnisse. ATMP ermöglichen neue Therapien für bislang unheilbare Krankheiten. Der Markt um diese Produkte befindet sich stark im Wachstum und gewinnt für die Pharmaindustrie immer mehr an Bedeutung. Herausfordernd sind jedoch die hohen Kosten bei der Produktion dieser zellbasierten Produkte. Diese Kosten entstehen durch die vielen manuellen Arbeitsschritte, die erforderlich sind. Demnach ist das Bestreben groß, die ATMP-Produktionsprozesse zu automatisieren und zu optimieren. Eine wichtige Voraussetzung hierfür sind effiziente Screening-Verfahren, die umfassende Qualitätskontrollen im Hochdurchsatz ermöglichen. Im Projekt StemCellFactory kommt bei der Life & Brain GmbH in Bonn hierfür ein High-Speed-Mikroskop zum Einsatz: Dort werden in einer vollautomatisierten Anlage iPS-Zellmodelle für die Therapieentwicklung bei neuropsychiatrischen Erkrankungen produziert.. Für die hier erforderlichen 100 %-Qualitätskontrollen und einen hohen Durchsatz eignet sich die High-Speed-Mikroskopie besonders [3].

Literatur
[1] W. Schenk, N. Brill, U. Marx, D. Hardt, N. König und R. Schmitt: High-speed microscopy of continuously moving cell culture vessels; Scientific reports, Jg. 6, S. 34038, 2016, doi: 10.1038/srep34038.

[2] T. Piotrowski et al.: Deep-learning-based multi-class segmentation for automated, non-invasive routine assessment of human pluripotent stem cell culture status; Computers in biology and medicine, Jg. 129, S. 104172, 2021, doi: 10.1016/j.compbiomed.2020.104172.

[3] B. Nießing, R. Kiesel, L. Herbst und R. H. Schmitt: Techno-Economic Analysis of Automated iPSC Production; Processes, Jg. 9, Nr. 2, S. 240, 2021, doi: 10.3390/pr9020240.

AUTOREN
Kai Janning M. Sc., Bastian Nießing M. Sc., Dipl.-Phys. Niels König, Prof. Dr.-Ing. Robert H. Schmitt
Fraunhofer-Institut für Produktionstechnologie IPT, Aachen
Tel.: 0241 8904-0
info@ipt.fraunhofer.de
www.ipt.fraunhofer.de

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