Kuh, Ziege, Schaf?

Automatisierte Nukleinsäure-Extraktion liefert hochwertige DNA für die Lebensmittelkontrolle

Die Nukleinsäure-Extraktion aus Lebensmittelproben ist die Grundlage für zuverlässige Folgeuntersuchungen in der Lebensmittelkontrolle. So benötigen PCR-basierte Nachweisverfahren hochwertige DNA, um zuverlässige Analysen zu liefern. Automatisierungstechnik und optimierte Extraktions-Kits sind – gerade bei einem hohen Probenaufkommen – der Schlüssel für effiziente und zuverlässige Extraktionsprozesse.

Die Qualität der Inhaltsstoffe und die gesundheitlichen Aspekte von Lebensmitteln werden, nicht zuletzt aufgrund der Lebensmittelskandale der Vergangenheit, immer wichtiger für Konsumenten. Die Lebensmittelindustrie setzt daher verstärkt auf Transparenz und hochwertige Inhaltsstoffe, um verlorenes Verbrauchervertrauen zurück zu gewinnen. Der Kontrollaufwand sowohl intern bei Herstellern als auch in externen Auftragslaboren und durch behördliche Aufsichtsorgane ist infolgedessen gestiegen.

Herkunftsanalyse mit PCR 

Ein wichtiges Untersuchungskriterium ist dabei die Herkunft der verwendeten Rohmaterialien und deren genetischer Hintergrund. Es geht dabei unter anderem um Fragen der Authentizität und der Richtigkeit der Verpackungsangaben. Für die Herkunftsanalyse kommen meist PCR-basierte Verfahren zum Einsatz. PCR dient der Vervielfältigung von DNA-Spuren – hier aus den zu untersuchenden Inhaltsstoffen. Ist beispielsweise nur wenig oder gar keine Ziegenmilch im Ziegenkäse, lässt sich dies mit PCR sicher bestimmen. Auch winzigste DNA-Spuren und hochfragmentierte DNA lassen sich mit PCR-Techniken nachweisen.

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Bild 1: Agarose-Gel-Elektrophorese von extrahierter DNA aus gefrorenen Garnelenproben. Reihe 1: DNA-Leiter; Reihe 2 – 5: Proben 1 – 4. © Analytik Jena

Voraussetzung für einen zuverlässigen PCR-basierten Nachweis sind Qualität und Menge der zuvor aus den Lebensmittelproben extrahierten DNA, was eine große Herausforderung darstellen kann. So enthalten z. B. Pflanzenproben oder Proben von stark prozessierten Lebensmitteln verschiedenste Inhaltsstoffe, die eine inhibierende Wirkung auf nachfolgende PCR-basierte Analysen haben können. Um derartige Störfaktoren auszuschließen, bedarf es eines optimierten Extraktions-Workflows – möglicherweise in Kombination mit einer Automatisierung. Die folgenden Untersuchungen von Garnelen, Haselnüssen und zwei Käsesorten geben einen Eindruck davon, wie das in der Praxis für unterschiedlichste Ausgangsmaterialien funktionieren kann.

Unterschiedliche Ausgangsmaterialien 

Für diese Untersuchungen wurden Eismeergarnelen, Haselnüsse sowie zwei verschiedene Käsesorten herangezogen. Die DNA wurde mit Hilfe des Innuprep DNA Kit-IPC16 bzw. des Innuprep Food DNA Kit-IPC16 von Analytik Jena extrahiert. Ausgeführt wurde die Extraktion mit dem Innupure® C16/C16 touch, einem Gerät zur automatischen Extraktion von Nukleinsäuren, das Liquid-Handling und Magnetpartikel-Separation vereint. Die Qualität der DNA wurde daraufhin mit Gelelektrophorese, Spektrophotometrie und für den Speziesnachweis mit quantitativer Real-Time-PCR (qRT-PCR) überprüft.

Dank der eingesetzten Automatisierungstechnik und den optimierten Kits (vorgefüllt mit allen für die Nukleinsäure-Extraktion benötigten Puffern und Magnet-Partikeln; versiegelte Puffer-Reservoirs) verringert sich die „Hands-on“-Zeit für die Labormitarbeiter erheblich. Zudem minimiert sich das Risiko von Probenverlusten und Fehlerquellen, die auf menschliches Handeln zurückzuführen sind.

Methoden und Material 

50 mg gefrorene Garnelen wurden in 200 µl H2O für 15 Sekunden in Lysis-Tubes mit einer Speedmill Plus von Analytik Jena homogenisiert. Danach wurde das homogenisierte Ausgangsmaterial mit 200 µl der Lösung CBV und 20 µl Proteinase K gemischt und bei 50 °C auf einem Schüttler (600 rpm) für 60 Minuten inkubiert. 400 µl des Lysates wurden daraufhin in die Reagenzplastik des Innuprep DNA Kit-IPC16 überführt, und die DNA wurde mit dem Innupure C16 extrahiert. 

100 mg und 200 mg Haselnuss wurden in 800 µl CBV und 20 µl Proteinase K resuspendiert. Die Lyse erfolgte für 60 Minuten bei 65 °C. 400 µl des Überstandes kamen für die Extraktion mit dem Innuprep Food DNA Kit-IPC16 und dem Innupure C16 zum Einsatz.

Bild 2: Extrahierte DNA aus 100 mg gemahlener Hasel­nuss, amplifiziert und detektiert mit qRT-PCR in Duplikaten (blaue Kurven unverdünnt, grüne Kurven 1 : 10 verdünnt). Bild 3: Extrahierte DNA aus 200 mg gemahlener Hasel­nuss, amplifiziert und detektiert mit qRT-PCR in Duplikaten (blaue Kurven unverdünnt, grüne Kurven 1 : 10 verdünnt). © Analytik Jena

Für die dritte Untersuchung wurden zwei kommerziell erhältliche Käsesorten ausgewählt. Ein Käse bestand laut Herstellerangaben aus Ziegenmilch, der andere aus Kuhmilch. Die Extraktion erfolgte mit dem Innuprep Food DNA Kit-IPC16 und dem Innupure C16 touch. Für jedes Replikat wurden 200 mg Probenmaterial verwendet. Das Elutionsvolumen betrug 100 µl. Nach der Extraktion wurden die Extrakte mit dem Spektrophotometer Scandrop® 250 und einer anschließenden quantitativen Real Time PCR (qRT-PCR) analysiert. Die qRT-PCR-Analyse erfolgte mittels Innudetect Cheese Assay und dem qTower3 von Analytik Jena unter Verwendung der Endpunktmethode, die die integrierte Software zur Verfügung stellt.

Ergebnisse 

Für die Garnelen konnte reine DNA mit A260/A280-Raten von 1,87 bis 2,32 gewonnen werden. Die erzielten mittleren Erträge von 22,1 ng/µl sind für Folgeuntersuchungen mittels PCR ausreichend. Die Agarose-Gelelektrophorese zeigt, dass ein Teil der DNA degradiert war, wie an der stark verwischten Linie in Bild 1 zu sehen ist. Diese Degradierung ist ein natürlicher Prozess, der kurz nach dem Tod der Tiere einsetzt und mit dem Einfrieren stoppt. Dennoch ist hier DNA mit einem hohen Molekulargewicht jenseits der 1 500 bp sichtbar.

Tabelle 2: Photometrische Analyse extrahierter Nukleinsäure aus Käseproben. Bild 4: Detektion schafsspezifisches Target-Gen. Bild 5: Detektion ziegenspezifisches Target-Gen. Bild 6: Detektion kuhspezifisches Target-Gen. © Analytik Jena

Die Extrakte der Haselnussproben wurden nach der Extraktion auf das Vorhandensein von Haselnuss-DNA mittels qRT-PCR untersucht. Um hemmende Effekte möglicher Inhaltsstoffe auf die PCR-Reaktion ausschließen zu können, wurden Aliquotes des Extrakts 1 : 10 verdünnt und anschließend wurden jeweils 10 µl des unverdünnten und des 1 : 10 verdünnten Extrakts amplifiziert. Wie die Bilder 2 und 3 zeigen, wird auch hier, sowohl für 100 mg als auch für 200 mg Probenmaterial, ein für qRT-PCR-Folgeuntersuchungen ausreichend großer DNA-Ertrag erzielt. Haselnuss und andere Ausgangsmaterialien mit hohen Lipid-Anteilen sind schwierig zu extrahierende Materialien. Hinzu kommt die Kontamination der extrahierten DNA mit PCR-Inhibitoren. In diesem Versuch konnte dies jedoch ausgeschlossen werden, dank der zehnfachen Verdünnung der Proben. Die Verdünnung hatte zur Folge, dass sich der Ct-Wert um 3,3 Zyklen für die Extrakte von 100 mg und 200 mg Ausgangsmaterial veränderte.

Die Analyse der verschiedenen Käseproben ist in den Bildern 4 und 5 dargestellt. Auch hier zeigt sich eine ideal große Menge an DNA für mögliche anschließende PCR-basierte Untersuchungen. Die Eluate wiesen Konzentrationen von 9 – 16 ng/µl auf. Proteine wurden komplett entfernt, wie das Verhältnis A260/A280 in Tabelle 2 zeigt. Die qRT-PCR-Analyse auf spezifische Gene von Schaf, Ziege und Kuh verdeutlicht, dass, wie deklariert, Ziegen-DNA und Kuh-DNA nur in den entsprechenden Käsesorten enthalten sind. Schafs-DNA fand sich, wie zu erwarten war, in keiner Probe.

Fazit 

Wie oben gezeigt, bietet die automatisierte Extraktion von Nukleinsäuren entscheidende Vorteile. Zum einen steigt die Geschwindigkeit des Extraktionsprozesses, was mehr Probendurchsatz in der gleichen Zeit erlaubt. Zum anderen steigt die Qualität der extrahierten DNA erheblich, da menschliche Fehlerquellen soweit wie möglich ausgeschlossen werden können und die Automatisierung eine große Einheitlichkeit der Extraktion gewährleistet. Diese Vorteile sind vor allem für Labore in der Qualitäts- und Sicherheitskontrolle von Lebensmitteln mit hohem Probenaufkommen und besonders hohen Effizienzstandards relevant. Die Qualitäts- und Geschwindigkeitssteigerungen gehen hier mit erheblichen Kosteneinsparungen für den täglichen Routinebetrieb einher. Die Qualität der extrahierten DNA ist durchweg hoch und damit ideal für weitere Untersuchungen mit PCR-basierten Nachweismethoden.

AUTORINNEN

Dr. Jana Felbel
Dr. Eileen Brandenburger
Analytik Jena AG

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