Multiplex-Assay

Legionellen durch PCR nachweisen

Der Autor von Biotecon Diagnostics beschreibt das PCR-Verfahren und seine Möglichkeiten bei der Bestimmung von Legionellen. Das beschriebene Multiplex-Assay wird quantitativ für die Wasseranalytik eingesetzt sowie qualitativ für die Koloniebestätigung nach ISO 11731.

Für das Ansetzen der PCR wird das DNA-Extrakt der Probe hier zu einem lyophilisierten Reagenzienmix pipettiert. © BIOTECON Diagnostics

Die Kulturmethode nach ISO 11731 ist derzeit das offizielle Verfahren für den Nachweis von Legionellen in Wasser. Bekannte Nachteile dieses Tests sind eine aufwändige Probenbearbeitung, schlechte Reproduzierbarkeit und die Langwierigkeit des Verfahrens. Die Ergebnisse liegen erst nach zehn bis vierzehn Tagen vor. Aus diesen Gründen suchen Anlagenbetreiber, Dienstleistungslabore sowie Behörden nach schnelleren und zuverlässigeren Nachweissystemen, die ergänzend zur Kulturmethode eingesetzt werden können. All diese Kriterien werden durch die PCR-Analytik erfüllt, die weltweit von Betriebslaboren zur Eigenüberwachung genutzt wird. Auch Dienstleistungslabore bieten diese schnelle Methode an. Anwender können Gefährdungssituationen so unmittelbar erkennen und frühzeitig Gegenmaßnahmen ergreifen.

Möglichkeiten des PCR-Legionellennachweises

Durch regelmäßiges Ermitteln der Legionellen-Konzentration in einer Anlage kann das Risiko einer Freisetzung von Legionellen eingeschätzt werden. Idealerweise wird hier aufgeschlüsselt nach Legionella spp. sowie den klinisch relevanten Spezies Legionella pneumophila und L. pn. Serogruppe 1. Das Ergebnis sollte Zellen in Amöben und Biofilmen mit einschließen und die ermittelte Konzentration muss sich auf lebende Legionellen beziehen. Auch muss das Verfahren robust sein, also auch für schwierigere Matrices einsetzbar sein. All das ist mit dem System „microproof® Legionella Quantification LyoKit“ in Kombination mit dem Aufbereitungsprotokoll des „foodproof® StarPrep Two Kit“ von Biotecon Diagnostics möglich. In weniger als vier Stunden liegt dem Anlagenbetreiber ein eindeutiges und umfassendes Ergebnis der Legionellen-Zellzahl vor, inklusive Unterscheidung der gefährlichsten Spezies.

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Das Gesamtverfahren wurde nach ISO/TS 12869:2019 validiert. Diese Norm gibt strenge Qualitätskriterien für den PCR-Nachweis von Legionellen vor und beschreibt auch den Ablauf einer Verifizierung für Prüflabore, welche die Akkreditierung des Verfahrens anstreben. Hervorzuheben ist, dass die Validierung auf einer Vielzahl von marktüblichen Real-Time-PCR-Geräten erfolgte und auch Abwasser und Kühlturmproben mit einbezog.

Möglichkeiten der PCR

Kerntechnologie dieses Real-Time-PCR-Testes ist der Nachweis spezifischer DNA-Moleküle der Legionellen. Das Endergebnis liegt normgemäß in „Genkopien pro Probevolumen“ vor. Da hier bei der Probenbearbeitung eine Lebend-Differenzierung mittels der Komponente „Reagent D“ erfolgt, entspricht dies der tatsächlichen Legionella-Lebendzellzahl. Nachteile typischer PCR-Verfahren, welche auch die DNA toter Zellen nachweisen, werden so umgangen.

DNA als Grundlage einer Nachweismethode zu verwenden ist in vielerlei Hinsicht vorteilhaft. Es wird keine Anzucht von Legionellen benötigt, und der Test ist hochspezifisch, nur die Zielorganismen werden detektiert. Nicht-Legionellen, die üblicherweise auf Agar für falsch-positive Ergebnisse sorgen, werden durch die PCR sicher ausgeschlossen. Aus diesem Grund spielt es auch keine Rolle, welche Arten von Begleitflora sich in der Probe befinden und wie hoch diese konzentriert sind. Säure- oder Hitzebehandlung, die zur Unterdrückung der Begleitflora in der Kulturmethode angewendet werden müssen, entfallen daher bei der PCR. Die einfachen Bearbeitungsprotokolle sind universell auf alle Wasserarten anwendbar, aufwändige Reinigungsverfahren für schmutzige Wässer sind nicht nötig. Zudem ermöglicht die PCR „Multiplexing“, also den gleichzeitigen Nachweis verschiedener Legionella-Arten in einer einzigen Analyse. Die Interpretation der Daten erfolgt automatisiert über ein Softwaretool. Ein solcher Test ist daher für den Anwender auch ohne PCR-Erfahrung leicht durchzuführen. Die Nachweisgrenzen des „microproof Legionella Quantification LyoKit“ sind mit denen des kulturellen Verfahrens nach ISO 11731 vergleichbar.

Kultur- versus PCR-Verfahren

Basierend auf der Kulturmethode wurden Grenzwerte festgelegt, die in „koloniebildenden Einheiten pro Volumen“ festgeschrieben sind. Noch existieren keine entsprechenden Werte für die Legionellen-PCR und das Ergebnis wird in Genkopien pro Volumen angegeben, dies entspricht der tatsächlichen Zellzahl. Würde für die Kulturmethode gelten, dass stets eine Legionella-Zelle in der Ausgangsprobe zu exakt einer Kolonie auf der Platte heranwächst, dann korrelierten die Ergebnisse der ISO 11731 und PCR sehr gut. Durch die oft ungenügende Genauigkeit der Kulturmethode gelingt eine derartige Umrechnung aber nicht ohne weiteres. Insbesondere bei komplexen Proben mit Biofilmanteilen oder Amöben liegen die ermittelten Koloniezahlen teils deutlich unter der tatsächlichen Zellzahl.

Studien, in denen Kultur und PCR verglichen wurden, zeigen, dass ein negatives PCR-Ergebnis mit 100%iger Sicherheit auch ein negatives Ergebnis der kulturellen Untersuchung nach sich zieht und dass die PCR sensitiver ist [Collins, 2017]. Die ermittelten Genkopien liegen in der Regel über den ermittelten Koloniezahlen derselben Probe. Das bietet einen Orientierungspunkt bei der Interpretation der Ergebnisse. Spätestens bei einem Ausbruchsgeschehen ist es unersetzlich, eine große Menge Proben mittels PCR schnell auf das Vorhandensein aller relevanten Legionellen zu prüfen. Diese Untersuchungen mündeten in einer Neufassung der Norm VDI 4259, welche Maßnahmen bei Legionellose-Ausbrüchen festlegt und explizit PCR als Analysemethode nennt. In der Routine eingesetzt, erfährt der Betreiber durch ein PCR-Screening, welche Teile des Systems Legionellen-belastet sind, und kann Maßnahmen durchführen, bevor eine Überschreitung kultureller Grenzwerte ein langes und kostspieliges Abschalten des Wasser- oder Kühlsystems erfordert.

Arbeitsablauf

Der Einsatz des Mittels „Reagent D“ von Biotecon Diagnostics macht bei der PCR-Methode die Lebend/tot-Unterscheidung möglich. © BIOTECON Diagnostics

Im Folgenden werden Verfahren und Arbeitsschritte bei Einsatz des „microproof Legionella Quantification Lyokit“, das mit allen gängigen Real-Time PCR-Geräten kompatibel ist, beschrieben. Die Legionellenanalytik mittels PCR beruht auf der in Laboren bereits gut etablierten Membranfiltration. Ein beliebiges Wasservolumen wird hierbei über PES-Membranen filtriert. Nicht filtrierbare Wässer können ohne Vorbehandlung direkt prozessiert werden. Ein drittes Protokoll ermöglicht es zudem, eine Probe aufzuteilen und parallel mittels PCR und der Kultur nach ISO 11731 zu analysieren. Diese drei Protokolle unterscheiden sich nur in den ersten Schritten der Probenbehandlung, es folgen im Anschluss die Lebend/tot-Unterscheidung und die DNA-Extraktion. Für diese gemeinsamen Schritte sind etwa 30 Minuten Bearbeitungszeit für zehn Proben einzuplanen, wobei mehr als die Hälfte auf Inkubationszeiten entfällt, in der andere Laborarbeit verrichtet werden kann.

Damit die PCR lebende von toten Zellen unterscheiden kann, erfolgt ein Behandlungsschritt mit der Reagenzie „Reagent D“ von Biotecon Diagnostics. Dieses Reagenz dringt nur in zellmembrangeschädigte (also tote) Zellen ein und bindet irreversibel an die DNA. Diese modifizierte DNA wird später nicht in der PCR detektiert, das Endergebnis entspricht folglich der Legionella-Lebendzellzahl.

Anschließend erfolgt die eigentliche Analyse in einem Real-Time-PCR-Gerät. In einem Durchlauf können bis zu 94 Proben parallel analysiert werden, die Laufzeit beträgt unabhängig von der Probezahl 2 ½ Stunden. Das Verfahren lässt sich darüber hinaus auch für die Bestätigung von Legionella-Kolonien nach ISO 11731 einsetzen. Hierbei vereinfacht sich der gesamte Arbeitsablauf so weit, dass pro Kolonie weniger als eine Minute Bearbeitungszeit benötigt wird. Die Laufzeit der PCR verkürzt sich ebenfalls, in etwa einer Stunde liegt das finale Ergebnis für bis zu 94 Kolonien vor.

Literatur
Collins, S., Stevenson, D., Walker, J. and Bennett, A. (2017): Evaluation of Legionella real-time PCR against traditional culture for routine and public health testing of water samples. J Appl Microbiol, 122: 1692-1703. https://doi.org/10.1111/jam.13461

AUTOR
Dipl.-Ing. Lukas Weise
BIOTECON Diagnostics GmbH, Potsdam
Tel.: 0331/2300-200
bcd@bc-diagnostics.com
www.bc-diagnostics.com

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