Krebszell-Kultivierung

Zellen in der dritten Dimension

Mit den realen Strukturen und Wachstumsbedingungen in Geweben und Organen haben 2D-Kulturen wenig gemeinsam. 3D-Zellkulturen umgehen die Limitationen. Sie können zuverlässig, streng kontrolliert und einfach skalierbar im Biorektor kultiviert werden. 

Künstliche Organe, Alternativen zu Tierversuchen oder neue Krebs-Therapien, das sind die ambitionierten Ziele vieler Forschungsansätze mit humanen und tierischen Zellkulturen. 3D-Zellkulturen spiegeln dabei die physiologischen Zusammenhänge im lebenden Organismus am besten wider. Besonders smart: Die kontrollierte Kultur im Bioreaktor.

3D ist besser für Zellen in Zellkulturen © Fotolia, omepl1

Seit Jahrzehnten werden tierische Zellen im Labor gezüchtet, üblicherweise in Petrischalen, Kulturflaschen oder Multi-Well-Platten. Adhärente Zellen binden dabei an die Glas- oder Kunststoff-Oberfläche des Gefäßes und breiten sich zu einem Zellteppich aus. Mit steigender Zelldichte vermindert sich meist die Teilungsrate der Zellen, die sogenannte Konfluenz setzt ein. Die Nähe der Zellen zueinander verhindert dabei ein weiteres Wachstum, es entsteht eine einschichtige 2D-Kultur. Diese Zellkulturen sind relativ einfach in der Handhabung, vergleichsweise kostengünstig und eignen sich gut zum Vermehren von Zellen im Labormaßstab.

2D oder 3D?
Mit den realen Strukturen und Wachstumsbedingungen in Geweben und Organen haben 2D-Kulturen aber wenig gemeinsam: Zell-Zell-Interaktionen entsprechen nicht der physiologischen Situation, es wirken völlig andere mechanische Kräfte und es fehlen die Komponenten der extrazellulären Matrix [1]. Dazu zählen verschiedene Makromoleküle wie Zelladhäsions- und Faserproteine, die in vivo den Zwischenraum der Zellen ausfüllen. Im Resultat zeigen Zellen aus zweidimensionalen Kulturen häufig eine veränderte Morphologie, untypische Zelldifferenzierungen und modifizierte Genexpression [2].

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Diese Limitationen umgeht die 3D-Kultur. Sie erlaubt die räumliche Orientierung der Zellen, schafft eine typische extrazelluläre Matrix und imitiert damit bestmöglich die natürlichen Wachstumsbedingungen und organspezifischen Zelleigenschaften. Die bessere Vergleichbarkeit mit mehrzelligen Strukturen in Mensch und Tier macht 3D-Zellkulturen zu geeigneten Modellen für die medizinische und pharmakologische Forschung. Bei Wirkstoff- und Medikamententestungen können sie Versuchstiere ersetzen. Anhand verschiedener 3D-Organmodelle, wie Haut, Leber oder Lunge, können Pharmakokinetik und -dynamik untersucht werden.

Auch in der Tumorbiologie, der Stammzellforschung und für die regenerative Medizin sind 3D-Kulturen von großer Bedeutung. Ohne eine korrekte dreidimensionale Anordnung von Zellen ist es weder möglich biologischen Organersatz zu erzeugen, noch lassen sich Zellveränderungen unter physiologischen Bedingungen studieren. 3D-Zellkulturen sind ein Motor der modernen Life Sciences.

Bild 1: Zellaggregate – so werden sie kultiviert © Eppendorf

Von der Zelle zum Verbund
Es gibt verschiedene Methoden, um Zellen in dreidimensionalen Strukturen zu kultivieren (Bild 1). Gängig sind beispielsweise 3D-Träger wie Kollagenschwämme, Kunststoffsubstrate oder Netze, die mit Komponenten der extrazellulären Matrix beschichtet werden. Eine andere Möglichkeit bieten Zellaggregate, so genannte Sphäroide. Hierbei wachsen Einzelzellen zu kugeligen Zellaggregaten heran. Dies wird zum Beispiel in der Krebsforschung häufig genutzt, da die dreidimensionale Anordnung der Zellen der in Tumoren ähnelt.

Wissenschaftler am portugiesischen iBET, dem Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica in Oeras, arbeiten mit genau solchen Tumorzellaggregaten. Klassischerweise werden Sphäroide in statischen Kulturen mit der „Hanging Drop“-Methode oder durch das Einbetten in Hydrogele gewonnen. Die iBET-Forscher sind nun einen neuen Weg gegangen: Sie haben getestet, ob ihre 3D-Tumorzellen auch im Bioreaktor angezogen werden können. Mit Erfolg!

Ab in den Bioreaktor – aber warum?
Im Vergleich zu den konventionellen Methoden der Sphäroid-Kultur bieten Bioreaktoren eine Reihe von Vorteilen. Sehr offensichtlich ist dabei die Skalierbarkeit. Während Zellaggregate mit klassischen Methoden im Mikrolitermaßstab kultiviert werden, erlauben Bioreaktoren Arbeitsvolumen von mehreren hundert Millilitern bis hin zu Litern. Das ermöglicht es schnell und unkompliziert große Mengen an Zellaggregaten herzustellen, wie sie für großangelegte Wirkstoff- und Toxizitäts-Screeningversuche nötig sind. Die strikte Kontrolle aller Prozessparameter im Bioreaktor sorgt außerdem für reproduzierbare Kultivierungsbedingungen und damit für eine gleichbleibende Qualität der Sphäroide. Bioreaktoren bieten damit die Basis für eine zuverlässige und zeitgünstige Produktion von Zellaggregaten in industrierelevanten Größenordnungen.

Bild 2: DASbox Mini-Bioreaktorsystem © Eppendorf

Tumorzellen im Mini-Bioreaktor
Für ihre Bioreaktorversuche mit den humanen Tumorzellenlinien H1650 und H157 haben die Wissenschaftler am iBET ein Eppendorf DASbox® Mini Bioreaktorsystem verwendet [3]. Dieses System erlaubt bis zu 24 parallele Zellkulturen mit Arbeitsvolumen zwischen 60 und 250 ml. Wichtige Kultivierungsbedingungen wie Temperatur, pH und Rührgeschwindigkeit und Gelöstsauerstoff-Konzentration können individuell und Software-basiert geregelt werden (Bild 2).

Rühren ist nicht gleich Rühren
Aber: Bei der Kultivierung von Zellaggregaten in gerührten Bioreaktoren müssen einige Aspekte bedacht und Parameter optimiert werden. Die Zellen sind vor zu großen Scherkräften zu schützen, damit sich Aggregate in der richtigen Größe und Form ausbilden können und keine Zellen beschädigt werden. Gleichzeitig sollte die Rührung aber so stark sein, dass die Aggregate in der Schwebe gehalten werden und eine gleichmäßige Versorgung mit Nährstoffen gewährleistet ist.

Da verschieden geformte Rührer zu unterschiedlicher Strömungsdynamik führen, haben die Wissenschaftler in ersten Versuchen die optimale Rührerform für ihre 3D-Tumorzellen identifiziert. Dafür wurden ein handelsüblicher 6-Blatt Rushton-Typ-Rührer, ein 3-Blatt-Rührer mit 30° Schräge und ein neu designter 8-Blatt-Rührer mit 60° Schräge bei jeweils unterschiedlichen Geschwindigkeiten getestet (Bild 3).

Bild 3: Der Rührer bedingt die Strömungsdynamik – somit hängt viel an der Wahl des „richtigen“ Rührers. A. Anzahl und Größe von Tumorzellaggregaten unterschieden sich je nach Rührerform und Drehgeschwindigkeit. B. Der neuartige 8-Blatt-Rührer mit 60° Schräge liefert vergleichbare Vitalität, Anzahl, Form- und Aggregatgröße zum Kontrollansatz mit einem Flachblatt-Rührer in Spinner-Gefäßen [1]. © Eppendorf

Perfusion – für Kulturen in Perfektion
Nachdem der getestete 8-Blatt-Rührer als bestes Werkzeug identifiziert war, haben die Forscher die Kultivierungsbedingungen genauer untersucht. Die grundlegenden Parameter waren bereits aus Vorversuchen bekannt [4]. In den anschließenden Untersuchungen haben die Wissenschaftler die Zellaggregate in Perfusionskultur vermehrt und den potenziellen Einfluss des Perfusions-Startpunktes analysiert (Bild 4).

Bei einer kontinuierlichen Kultivierung wird stets frisches Medium zugefügt, während zum Volumenausgleich mit der gleichen Flussgeschwindigkeit Flüssigkeit abgesogen wird. Bei der Perfusion werden darüber hinaus die Zellen oder Zellaggregate mit einer geeigneten Vorrichtung im Gefäß zurückgehalten. In der hier beschriebenen Studie wurde dazu ein Metallfilter mit einer Porengröße von 10 µm an das Absaugrohr montiert.

Via Perfusion können somit hohe Zelldichten im Bioreaktor erreicht werden. Durch die optimale Versorgung mit frischen Nährstoffen und das direkte Entfernen von Nebenprodukten wie Ammonium oder Laktat können Perfusionskulturen wesentlich länger als klassische Batch- oder Fed-Batch-Ansätze kultiviert werden. Vor allem für Langzeitstudien wie Wirkstoff-Toxizitätstests ist das ein klarer Vorteil.

Bild 4: Bioreaktor im Perfusionsmodus – so bilden sich 3D-Tumorzellaggregate. A. Fluoreszenzmikroskopie von 3D-Aggregaten bei Start der Perfusion am ersten Tag nach der Inokulation. Lebende Zellen zeigen grüne Färbung, rote Zellen sind abgestorben. B. Durchmesser der 3D-Aggregate aus Perfusionskultur. C. Anzahl der 3D-Aggregate pro ml Kultur und Zellzahl pro Aggregat. (Grün = Perfusionsstart an Tag 1 nach Inokulation, Blau = Perfusionsstart an Tag 3 nach Inokulation). © Eppendorf

Erfolgreich im Bioreaktor
Die Untersuchungen am iBET haben gezeigt, dass das DASbox Mini-Bioreaktorsystem von Eppendorf für das Kultivieren von Tumorzellaggregaten geeignet ist. Die Konzentration an Sphäroiden im Bioreaktor als auch deren Durchmesser und Morphologie entsprachen ebenso wie die Metabolitdaten bekannten Literaturwerten [5, 6]. Das Verwenden des neuartigen 8-Blatt-Rührers unterstützt bei entsprechender Agitationsgeschwindigkeit das Ausbilden von Aggregaten in gewünschter Größe und Form und verhindert das Sedimentieren der Zellen. Neben den hier präsentierten Tumorzellen können auch andere Zellaggregate erfolgreich im Bioreaktor vermehrt werden, so zum Beispiel humane pluripotente Stammzellen [7].

Kurzum: 3D-Zellkulturen können zuverlässig, streng kontrolliert und einfach skalierbar im Biorektor kultiviert werden. In Kombination mit den umfangreichen Dokumentationsoptionen der DASware® Bioprozess-Software Suite eröffnen Eppendorf-Biorektoren damit den Weg für die effiziente Nutzung von Zellaggregaten im industriellen Maßstab.

Literatur
[1] Discher DE, Janmey P, Wang Y. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science 310: 1139 – 1143, 2005.
[2] Duval K, Grover H, Han LH, Mou Y, Pegoraro AF, Fredberg J and Chen Z. Modeling
Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Physiology 32 (4): 266 – 277, 2017.
[3] Roldão A, Sousa M, Santo VE, Becken U and Serra M. Culture of 3D Cells Aggregates
in Perfusion in a DASbox® Mini Bioreactor System. Eppendorf Application Note No. 360, 2018.
[4] Simão D, Arez F, Terasso AP, Pino C, Sousa MFQ and Alves PM. Perfusion stirred-tank bioreactors for 3D differentiation of human neural stem cells. In Bioreactors in Stem Cell Biology (Turksen K. editor). Humana Press. Canada. 129 – 142, 2016.
[5] Santo VE, Estrada M, Rebelo S, Silva I, Pinto C, Veloso S, Serra AT, Boghaert E, Alves PM and Brito C. Adaptable stirred-tank cultures for large scale production of multicellular spheroid-based tumor cell models. Journal of Biotechnology 221: 118 – 129, 2016.
[6] Zeng AP, Hu WS and Deckwer WD. Variation
of Stoichiometric Ratios and their Correlation for Monitoring and Control of Animal Cell Culture. Biotechnology Progress 14 (3): 434 – 441, 1998.
[7] Olmer R, Kropp C, Huether-Franken C, Schlottbom C and Robert Zweigerdt. Scalable
Expansion of Human Pluripotent Stem Cells in Eppendorf BioBLU® 0.3 Single-Use Bioreactors, Eppendorf Application Note No. 292, 2013.

AUTOREN

António Roldão, Marcos Sousa, Vitor E. Santo, Margarida Serra
Universidade Nova de Lisboa und iBET, Instituto de Biologia Experimental e Tecnológica O eras , Portugal

Ulrike Becken
Eppendorf AG, Bioprocess Center
Jülich

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