Von der 2D-Kultur zum Organ-on-Chip

Wie geht’s den Zellen?

Einige Ansätze von Organ-on-Chip- und Human-on-Chip-Systemen verwenden bereits Mikrosensoren. Für viele andere Systeme könnte metabolisches Monitoring ein großer Gewinn sein.

Bei Organ-on-Chip-Systemen gibt es bei der Sensorik – im Vergleich zur Entwicklung im Bereich der Mikrofluidik – Nachholbedarf. © Uni Freiburg, IMTEK-Sensoren

Der Trend zu Organ-on-Chip- und Human-on-Chip-Systemen hat Auswirkungen auf viele unterschiedliche Gebiete, wie z. B. auf die Krebsforschung, die Toxikologie, das Pharma-Screening, auf Tierversuchs-ersatzmethoden, aber auch auf die physiologische Grundlagenforschung. Einige Ansätze verwenden bereits Mikrosensoren, für viele andere Systeme könnte metabolisches Monitoring ein großer Gewinn sein.

Ausgehend von einfachen 2D-Zellkulturen bis hin zu Organ-on-Chip (OOC) gab es in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte, was die Aussagekraft von Zellkulturmodellen in der medizinischen Forschung stark erhöht hat. In OOC sind Zellen nicht nur in der natürlichen, dreidimensionalen Geometrie im Verbund angeordnet, sondern weisen in ihrer Gesamtheit organotypische Funktionen auf. Beim Einsatz von humanen Zellen ergibt sich sogar die Möglichkeit in einem OOC-System bessere Ergebnisse als in einem Tiermodell zu erzielen, womit wesentlich zur Vermeidung von Tierversuchen beigetragen werden kann. 

Aktuell werden OOC vor allem in der Grundlagenforschung eingesetzt; in naher Zukunft im Bereich Arzneimittelforschung und schließlich in der personalisierten Medizin. Konsequenterweise können mehrere solcher OOC-Systeme gekoppelt werden, um damit ein sogenanntes Human-on-Chip-Modell zu realisieren. Solche Systeme versprechen einen systemischen Test von Wirkstoffen, ohne dass Tierversuche nötig sind.

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Bereits in den 90er-Jahren gab es einige Mikrosensorsysteme, um den Zellmetabolismus in 2D-Kulturen zu messen und gleichzeitig über eine geeignete Mikrofluidik verschiedene Stimuli zu setzen. Anfänglich waren es pH- oder Sauerstoffsensoren auf Silicium-Chips, später kamen Biosensoren hinzu, und transparente Sensor-Chips wurden eingesetzt. Parallel wurden fluoreszenzbasierte Sensoren, überwiegend zur Messung von Sauerstoff etabliert. Deutlich weniger Fortschritt gibt es bei der Integration von Sensorik in 3D-Zellkulturen und in OOC. Die bestehenden Systeme sind vielversprechend, aber insbesondere für OOC-Systeme gibt bei der Sensorik, im Vergleich zur Entwicklung im Bereich der Mikrofluidik, Nachholbedarf.

Anwendung: Messen metabolischer Parameter
Fast alle Bereiche, in denen Zellkulturen in Forschung und Medizin eingesetzt werden, profitieren von Mikrosensoren zur Messung von metabolischen Parametern. Dabei können die Sensoren zur Standardisierung der Kulturbedingungen genutzt werden (z. B. Einstellen des Sauerstoffgehalts), zur Messung zellulärer Kenngrößen (z. B. der Respirationsrate) oder als Indikator für den Zellmetabolismus (z. B. um zu erkennen, ob ein bestimmter Wirkstoff die Zellatmung hemmt).

Entsprechend breit sind auch die Fachgebiete, in denen solche Mikrosensorsysteme eingesetzt werden: In der physiologischen Grundlagenforschung, in der pharmazeutischen und medizinischen Forschung (hier insbesondere in der Krebsforschung), ist die Kenntnis des Zellmetabolismus und dessen zeitliche Veränderung zentral. In der Toxikologie und beim Pharma-Screening können zu testende Stoffe oder Wirkstoffe als Stimuli in Zellkulturen eingebracht und mittels Sensoren die Auswirkungen auf den Metabolismus dynamisch verfolgt werden. Besonders in diesen Bereich kann durch den Einsatz von Mikrosensorsystemen die Aussagekraft von Zellkultur- und OOC-Methoden deutlich verbessert werden und damit entscheidend zu deren Potenzial als Tierversuchsersatzmethoden beigetragen werden.

In der personalisierten Medizin kann der Zellmetabolismus an von Patienten entnommenen Zellen untersucht werden, beispielsweise um zu testen, bei welchen Chemotherapeutika Tumorzellen optimal ansprechen. Im Bereich der Zelltherapie können Mikrosensorsysteme wesentlich zur Qualitätssicherung beitragen, indem die Kulturbedingungen der Zellen überwacht werden, bevor sie in den Patienten transplantiert werden.

Ausgangslage 2D-/3D-Kulturen
Eukaryotische Zellen in 2D-Kultur wachsen typischerweise als Monolage, bestehend aus zehn- bis hunderttausenden von Zellen, die auf dem Boden eines Kulturgefäßes anhaften. Im dreidimensionalen Fall handelt es sich um untereinander haftende Zellagglomerate aus üblicherweise mehreren tausend Zellen, z. B. in Form von Sphäroiden. Diese Agglomerate haften nicht an der Gefäßoberfläche, sondern sind entweder frei im Medium oder in einer Gel-Matrix (z. B. Matrigel) eingebettet.

Über das Kulturmedium werden die Zellen mit Nährstoffen – im Wesentlichen Glucose – versorgt. Glucose ist normalerweise im Übermaß (5 – 20 mM) im Medium vorhanden und wird mit der Zeit verbraucht. Dabei entsteht, je nach Ausmaß des anaeroben Stoffwechsels, Lactat in einem vergleichbaren Konzentrationsbereich. Die extrazelluläre Ansäuerung sorgt für ein Absinken des pH-Werts im Zellkulturmedium vom neutralen Wert um typischerweise eine pH-Einheit.

Bild 1: Konzentrationsgradienten bestimmen die Mikroumgebung der Zellen in 2D-Kultur (A), 3D-Kultur mit Sphäroiden (B) und beim dynamischen Monitoring (C). Die rötliche Farbe symbolisiert die Akkumulation von zellulären Abfallprodukten oder die zunehmende Verarmung von Sauerstoff. © Uni Freiburg, IMTEK-Sensoren

Sauerstoff wird über die Inkubatoratmosphäre eingestellt und löst sich dann in entsprechender Konzentration im Medium. Unter Normalbedingungen ist dies eine deutlich geringere Konzentration als mit Glucose (etwa 200 µM gelöster Sauerstoff), in hypoxischen Kulturen ist die Konzentration noch wesentlich niedriger. Der Transport im Medium findet dann über Diffusion statt. In 2D-Zellkulturen stellt sich entlang der Medienhöhe ein Konzentrationsgradient ein (Bild 1A), da die Zellen am Gefäßboden fortwährend Sauerstoff verbrauchen. Hier können auf Zellebene schnell hypoxische Bedingungen erreicht sein, obwohl über den Inkubator normoxische Bedingungen eingestellt werden. Eine integrale Messung über das gesamte Medienvolumen oder ein Absaugen des Überstandes zur Messung ist hier nicht zweckmäßig. Überwacht werden können die lokalen Konzentrationen z. B. durch Mikrosensoren, die in den Boden des Kulturgefäßes integriert sind und somit die relevanten Konzentrationen direkt in der Nähe der Zellen (perizellulär) wiedergeben.

Allgemein ist in 3D-Kultur die Zellzahl oft deutlich geringer als in 2D. Dementsprechend sind die Konzentrationsänderungen kleiner und wesentlich lokaler. Also müssen Empfindlichkeit, Messbereich und Design von Sensoren angepasst werden. Da die Zellen heterogen im Raum verteilt sind, entstehen Konzentrationsgradienten radial von den Zellagglomeraten weg (Bild 1B). Zudem entstehen in diesen Mikrogeweben auch interne Konzentrationsgradienten, sie haben beispielsweise oft einen hypoxischen Kern.

Anspruchsvolle Mikrofluidik
Mittels Mikrofluidik kann ein sehr kleines Medienvolumen (ca. 10 µl) über oder neben den Zellen definiert werden, in dem sich Stoffwechselparameter dann schnell ändern. Für das Überleben der Zellen ist es wesentlich, dass dieses Volumen permanent ausgetauscht wird (Bild 1C). Die schnelle Änderung der Metabolitenkonzentration, oft innerhalb einiger Minuten im Vergleich zu Tagen in klassischen Kulturgefäßen, wird beim dynamischen Zellkulturmonitoring ausgenutzt, um schnell Stoffwechselraten zu bestimmen und Veränderungen unter Wirkstoffzugabe zu beobachten. Im 2D-Fall mit fest anhaftenden Zellrasen kann ein Medienüberstand in mikrofluidischen Stopp-/Fluss-Zyklen einfach abgesaugt werden. In 3D-Kultur gestaltet sich der mikrofluidische Zugang anspruchsvoller. Hier müssen entweder Mikrostrukturen eingesetzt werden, die das Wegspülen von Zellagglomeraten verhindern, oder Mikrokanäle in der Matrix müssen ausgespart werden, um Medium an den Zellen vorbeizuführen.

Eine detaillierte Diskussion der Ausgangslage und den Implikationen für die Mikrosensorsysteme findet sich in [1]. Allgemein können die Systeme für das Monitoring des Zellmetabolismus durch folgende grundlegende Fragen charakterisiert werden:

  • Wie werden die Zellen mit Nährstoffen versorgt?
  • Wie werden externe Stimuli gesetzt?
  • Wie kommen die Stoffwechselparameter zur Mikrosensorik?
Bild 2: Sensing Cell Culture Flask (SCCF) – Mikrosensoren sind in den Boden einer Zellkulturflasche integriert (A), Detailansicht Sensorchip (B), Racksystem zum parallelen Betrieb von vier SCCFs (C). © Uni Freiburg, IMTEK-Sensoren

Lösungen für statisches und dynamisches Monitoring
Mikrosensoren für das statische Monitoring in 2D-Zellkultur werden meist in übliche Zellkulturgefäße integriert. Ein Beispiel ist die „Sensing Cell Culture Flask“, bei der ein Sensorchip mit elektrochemischen Sensoren in eine Zellkulturflasche integriert ist (Bild 2). Die Nährstoffversorgung erfolgt aus dem stehenden Medium, das nach einigen Tagen gewechselt wird. Stimuli können über Veränderung der Medienzusammensetzung oder durch die Inkubationsbedingungen gesetzt werden; die Stoffwechselparameter werden mit dem Sensorchip erfasst, auf dem die Zellen siedeln. Damit konnte beispielsweise die Relevanz von perizellulärem Sauerstoffmonitoring in der Hypoxieforschung mit Krebszellkulturen gezeigt werden [2,3].

Dynamisches Monitoring erlaubt die schnelle Änderung von Konzentrationen mittels Mikrofluidik und gleichzeitiges Messen der Stoffwechselparameter, wie es mit dem in Bild 3 gezeigten, nur zuckerwürfelgroßen Lab-on-Chip möglich ist. Die Zellen werden direkt auf dem Chip als Monolage kultiviert und erhalten ihre Nährstoffe durch die zyklische Auffrischung des Mediums. Elektrochemische Sensoren für Sauerstoff und pH befinden sich in dem Bereich, in dem die Zellen kultiviert werden; Biosensoren für Glucose und Lactat sind im Auslasskanal untergebracht. Damit lässt sich beispielsweise der Stoffwechsel von Krebszellen bei und nach Gabe von Wirkstoffen beobachten [4].

Ein wesentlicher Vorteil des kontinuierlichen Monitorings ist die Möglichkeit auch temporäre oder Recovery-Effekte zu erfassen, da kontinuierlich Stoffwechselraten bestimmt werden können – und nicht nur am Endpunkt, z. B. durch externe Analyse des Mediums mit klassischen Methoden wie HPLC.

Das dynamische Monitoring in 3D-Zellkulturen wurde beispielsweise in einem System mit in hängenden Tropfen kultivierten Sphäroiden und Biosensoren realisiert [5]. Die Gruppe der ETH Zürich konnte zeigen, dass mit dem System der Glucoseverbrauch und die Lactatsekretion von Sphäroiden aus humanen Darmkrebszellen bestimmt werden kann.

Besondere Herausforderungen
Grundsätzlich darf nie vergessen werden, dass der Einsatz von Mikrosensoren auf die Messung der extrazellulären Situation beschränkt ist und nur indirekt Aussagen über die Vorgänge in der Zelle getroffen werden können. Alternativen, beispielsweise die Verwendung von Farbstoffen, um direkte Informationen über intrazelluläre Vorgänge zu erhalten, sind üblicherweise zu invasiv für kontinuierliche Messungen des „ungestörten“ Zustands der Zellen. Daher sind Mikrosensorsysteme für die kontinuierliche Messung des Zellmetabolismus, trotz des indirekten Ansatzes, das Mittel der Wahl.

Während in 2D-Zellkultur Mikrosensoren leicht perizelluläre Messwerte liefern können, sind planare Sensoren in 3D auf die Messung von Randwerten limitiert. Hier benötigt es entsprechend integrierte Sensoren, die beispielsweise entlang einer Achse durch die Kultur genügend Informationen sammeln, um schließlich den metabolischen Zustand für alle Zellen zu interpolieren. Besonders herausfordernd ist dies bei den radialen Gradienten innerhalb von Sphäroiden. Hier ist, ausgehend von den aktuellen Mikrosensoren, eine drastische Miniaturisierung nötig, um ausreichend minimalinvasiv Messungen innerhalb der Sphäroide zu ermöglichen.

Eine besondere Herausforderung für das Systemdesign ergibt sich bei der Messung von reaktiven, kurzlebigen Substanzen, wie zum Beispiel reaktive Sauerstoff- oder Stickstoffspezies (ROS/RNS). Als Verursacher von oxidativem Stress haben ROS/RNS sowohl physiologisch als auch pathologisch große Bedeutung. Sie liegen jedoch oft nur in sehr kleinen Konzentrationen (nM) und für sehr kurze Zeitspannen vor (Halbwertszeiten im Sekundenbereich oder deutlich darunter). Entsprechend kurz sind auch die Wege, die sie durch Diffusion zurücklegen können, bevor sie zerfallen.

Fazit
Mikrosensorsysteme zur Messung von Stoffwechselparametern in Zellkultur sind wichtig für die Standardisierung der Kulturbedingungen, erlauben die Messungen von zellulären Kenngrößen und können zur Indikation von Stoffwechselveränderungen in Screening-Anwendungen genutzt werden. In 2D-Kultur ist die Relevanz von metabolischem Monitoring vielfach gezeigt, sowohl zur Kontrolle der Kulturbedingungen als auch zur Beobachtung des Stoffwechsels selbst. Für 3D-Zellkulturen bzw. Organ-on-Chip-Systeme wird aktuell an vergleichbar performanten Systemen geforscht. Solche Systeme sind vielversprechend für zahlreiche Anwendungen und können entscheidend zur Effizienz klinischer Therapiemethoden und zur Vermeidung von Tierversuchen beitragen.

Förderung
Die vorgestellten Arbeiten wurden von der Europäischen Union im 6. Rahmenprogramm im Projekt EUROXY (Bewilligung LSCH-CT-2003-502932), im 7. Rahmenprogram im Projekt METOXIA (Bewilligung HEALTH-F2-2009-222741) und vom Bundesministerium für Bildung und Forschung im Projekt Biosens-MetaScreen (FKZ 16SV2369) gefördert.

Referenzen

  1. Kieninger J, Weltin A, Flamm H, Urban GA. Microsensor systems for cell metabolism – from 2D culture to organ-on-chip. Lab Chip 2018, 18, 1274-1291.
  2. Kieninger J, Tamari Y, Enderle B, Jobst G, Sandvik JA, Pettersen EO, Urban GA. Sensor Access to the Cellular Microenvironment Using the Sensing Cell Culture Flask. Biosensors 2018, 8, 44.
  3. Kieninger J, Aravindalochanan K, Sandvik JA, Pettersen EO, Urban GA. Pericellular oxygen monitoring with integrated sensor chips for reproducible cell culture experiments. Cell Prolif 2014, 47, 180-188.
  4. Weltin A, Slotwinski K, Kieninger J, Moser I, Jobst G, Wego M, Ehret R, Urban GA. Cell culture moni-toring for drug screening and cancer research: a transparent, microfluidic, multi-sensor microsystem. Lab Chip 2014, 14, 138-146.
  5. Misun PM, Rothe J, Schmid YRF, Hierlemann A, Frey O. Multi-analyte biosensor interface for real-time monitoring of 3D microtissue spheroids in hanging-drop networks. Microsyst Nanoeng 2016, 2, 16022.
  6. Flamm H, Kieninger J, Weltin A, Urban GA. Superoxide microsensor integrated into a Sensing Cell Culture Flask microsystem using direct oxidation for cell culture application. Biosens Bioelectron 2015, 65, 354-359.


AUTOREN
Dr.-Ing. Jochen Kieninger
Dr.-Ing. Andreas Weltin

Beide forschen an der Professur für Sensoren am Institut für Mikrosystemtechnik (IMTEK) der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg unter anderem zu Mikrosensoren für Organ-on-Chip-Systeme.

www.imtek.de/sensoren

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