Von Forschung bis Qualitätskontrolle: Die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) ist ein leistungsfähiges Analyseverfahren, das in vielen Forschungs- und Produktionsbereichen, z. B. in der Chemie, Pharmazie, Biotechnologie und Umweltanalyse eingesetzt wird. Kernfunktionen der HPLC sind die Trennung, Identifizierung und Quantifizierung von Verbindungen in komplexen Gemischen. Eine Stärke der HPLC-Technik liegt darin, ein breites Spektrum von Probentypen verarbeiten zu können, ob kleine Moleküle, große Biomoleküle oder Polymere.

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Bild 1: Korrekte Verschraubung und zwei Beispiele für mangelhafte Verschraubungen einer Kapillare im Säulenkopf. © Shimadzu

Ein weiterer Einflussfaktor auf die Peakform ist die Verschraubung der Kapillare in die Enden der Trennsäule. Diese Verschraubung muss ohne ein Totvolumen (s. Bild 1) erfolgen, da dies dann durch Vermischung mit dem Lösungsmittel zu einer Verbreiterung von Peaks, die normalerweise scharf getrennt wären, führen kann.

Rauschen der Basislinie

Um das Problem eines Basislinienrauschens bei HPLC-Messungen zu lösen, sind mehrere Einflussfaktoren zu berücksichtigen. Die mobile Phase hat auch in diesem Fall einen großen Einfluss auf die Basislinie. Die mobile Phase muss ordnungsgemäß vorbereitet und frei von Verunreinigungen sein. Das Filtern der Flüssigkeit durch Ansaugfilter oder spezielle Filtersysteme sowie das Entgasen mit einem Online-Entgasungssystem sollten zum Standard gehören. So werden Partikel und Luftblasen aus dem System gehalten.

In diesem Zusammenhang lohnt sich auch ein Blick auf die Wasseraufbereitungsanlage, die das Wasser produziert, mit dem dann Puffer angesetzt werden. Denn bei unzureichender Wartung der Anlage können sich z. B. Mikroorganismen bilden, die das Wasser verschmutzen. Die Anwender sollten außerdem das HPLC-System auf undichte Stellen oder Luftblasen im Innern der Durchflusszelle des Detektors sowie an den Verschraubungspunkten des Injektionsventils und der Säule überprüfen, da diese ein Rauschen verursachen können.

Kalibrierung und Optimierung der Detektoreinstellungen, wie z. B. das Anpassen des Detektor-Gain oder der Lampenintensität, können ebenfalls zur Verringerung des Grundlinienrauschens beitragen.

"Gute" oder "schlechte" Basislinie? Grundsätzlich ist für die Beurteilung des Basislinienrauschens sinnvoll, eine Messung mit einer Leerinjektion vor jeder Messreihe durchzuführen und so eine Referenzline zu erhalten.

Retentionszeitverschiebung

Ein ebenfalls häufiges Problem in der HPLC sind Retentionszeitverschiebungen. Diese können durch mehrere Strategien behoben werden. Schwanken die Retentionszeiten, sind sie also von Tag zu Tag unterschiedlich, ist zu prüfen, ob die Zusammensetzung der mobilen Phase, die Lösungsmittelverhältnisse, der pH-Wert und die Pufferkonzentrationen an jedem Tag identisch sind. Diese Problemlösung klingt trivial, aber es ist häufig der Fall, dass verschiedene Anwender die Verbrauchsmittel der HPLC unterschiedlich ansetzen und dies zu anderen Mischungsverhältnissen führen kann, was wiederum ursächlich für unterschiedliche Retentionszeiten ist.

Darüber hinaus sind die regelmäßige Wartung und die richtige Pflege der Säule von entscheidender Bedeutung. Säulen sollten in Regalen und niemals in Schubladen aufbewahrt werden, denn das ständige Öffnen und Schließen der Schublade kann die stationäre Phase in der Säule beschädigen. Darüber hinaus empfiehlt es sich, die Säule durch die regelmäßige Untersuchung mit Säulenstandards auf Alterungserscheinungen zu überprüfen, wie im jeweiligen Säulenbeiblatt beschrieben. All dies sollte in einem Säulentagebuch genau dokumentiert werden.

Bild 2: Effekt der Säulenäquilibrierungsdauer auf die Reproduzierbarkeit der Peak-Retentionszeit. Oben: Säulenäquilibrierungszeit ausreichend; unten: Säulenäquilibrierungszeit zu kurz © Shimadzu

Wichtig ist auch die Einhaltung konstanter Betriebsbedingungen wie Säulentemperatur und Systemdruck, da Abweichungen die Retentionszeiten beeinflussen können.

Eine unzureichende Äquilibrierung der Säule am Ende einer Messung mit Lösungsmittelgradient kann ebenfalls wandernde Peaks verursachen. Wie in Bild 2 dargestellt, sind die Chromatogramme in oberen Teil gut reproduzierbar, da durch eine ausreichende Säulenäquilibrierung (Gradient in Rotbraun) die Startbedingungen der Messung wieder voll erreicht werden. Im Gegensatz dazu zeigen die unteren Chromatogramme, dass sich die Peaks zu kürzeren Retentionszeiten verschieben. Dies liegt an einer zu kurzen Säulenäquilibrierung, wodurch der Konzentrationsanteil der mobilen Phase B in der Säule beim Messstart noch viel zu hoch ist. Ähnlich zeigt sich auch eine mangelnde Vorbereitung der Säule zu Beginn der Messungen. Wird die gerade eingebaute Säule direkt für Messungen verwendet, können die Peaks in Chromatogrammen der ersten Probeninjektionen stark schwanken, da das Lösungsmittel, in dem die Säule gelagert wurde, noch nicht vollständig durch die mobile Phase ersetzt ist.

Säulenüberdruck und Druckschwankungen

Schwankungen des Pumpendrucks führen unweigerlich dazu, dass Messergebnisse nicht reproduzierbar werden und bspw. Peakformen oder Retentionszeiten sich ändern. Eine Fehlerursache können Luftblasen im System sein. In diesem Zusammenhang ist zu beachten, dass Luftblasen, die sichtbar in den Ansaugschläuchen der Pumpen auftauchen, nicht durch einen Online-Entgaser entfernt werden können. Diese Geräte können nur die in der mobilen Phase gelösten Gase entfernen. Luftblasen, die angesaugt werden, laufen durch das komplette System und können sich dort absetzen. Daher sollte möglichst vermieden werden, größere Mengen Luft durch die Pumpe anzusaugen.

Bei einem Systemüberdruck bzw. für die Methode untypisch hohen Druck sind mehrere Schritte zur Fehleranalyse notwendig. Zunächst sollte das System durch eine Untersuchung der Schläuche und Anschlüsse auf Verstopfungen oder Lecks überprüft werden. Folgende Problempunkte sind typisch: der verstopfte Linefilter, der getauscht bzw. gereinigt werden kann, die verstopfte Vorsäule, die dann getauscht werden muss, oder die – durch häufiges Festschrauben – verbogene Eingangskapillare in die Säule, die ersetzt werden muss.

Bild 3: Vorgehensweise zur Identifizierung des Bauteils, das den Systemüberdruck verursacht: Beobachten des Systemdrucks an der Pumpe bei Entfernen der Systemabschnitte von hinten beginnend. © Shimadzu

Um das Bauteil zu identifizieren, das den Überdruck produziert, muss man die Änderung im Systemdruck beobachten, der am Pumpenkopf gemessen wird. Dazu wird jeder Abschnitt (in Bild 3 durch rote Linien gekennzeichnet) einzeln abgetrennt, und zwar jeweils ein Abschnitt zu einem Zeitpunkt, beginnend bei "1." am unteren Ende der Flusslinie.

Probenverschleppung

Auch die Verschleppung einer Probe in nachfolgende Messungen kann durch unterschiedliche Maßnahmen vermieden bzw. möglichst geringgehalten werden. In erster Linie ist es wichtig, das Injektionssystem zwischen den Proben gründlich zu spülen und zu reinigen, um das Risiko einer Verschleppung zu minimieren. Dies wird durch die Verwendung geeigneter Lösungsmittel erreicht, welche die Probe vollständig lösen können. Zusätzlich haben HPLC-Systeme mit dem System der Direktinjektion den Vorteil gegenüber Systemen mit einer Loop-Injektion, dass die Injektionsnadel während der Messung mit dem Lösungsmittelgradienten gespült wird. Bei diesen Systemen ist von vornherein das Risiko einer Verschleppung gemindert.

Schlechte Reproduzierbarkeit

Um eine schlechte Reproduzierbarkeit bei der HPLC zu vermeiden, gibt es mehrere Möglichkeiten.

Zunächst gilt es, eine sinnvolle Probenvorbereitungsmethode zu entwickeln, die auch genaue und konsistente Probenextraktion, Probenmischung, Verdünnung und Filtration beinhaltet. Fehler, die an dieser Stelle entstehen, können selbst durch High-End-Messgeräte später nicht wieder ausgeglichen werden.

Ferner ist zu beachten, dass temperatur-, licht- oder luftempfindliche Proben unter entsprechend geeigneten Bedingungen gehandhabt werden müssen. Ansonsten ist eine schlechte Reproduzierbarkeit der Messergebnisse unvermeidlich.

Auch an der HPLC-Hardware können sich an unterschiedlichsten Stellen Fehler einschleichen, die eine schlechte Reproduzierbarkeit zur Folge haben. Die prägnanteste Stelle ist der Autosampler, an dem mehrere Schaltventile für das präzise Pipettieren und Injizieren der Proben verantwortlich sind. Durch die häufigen Schaltungen der Ventile können durch Verschleiß Undichtigkeiten entstehen, die zu einer schlechten Reproduzierbarkeit der Injektionsvolumina und damit auch der Messergebnisse führen.

Fazit

In diesem Artikel wurden einige Fallstricke in der Flüssigchromatographie und mögliche Lösungswege vorgestellt. Grundsätzlich ist zur Vorbeugung von Problemen immer auf eine regelmäßige Wartung der Systeme nach den Herstellervorgaben im Handbuch zu achten; auf diese Weise können viele Probleme vermieden werden. Außerdem empfehlen sich die Verwendung eines Säulentagebuchs und regelmäßige Tests der Säulen, um deren Status zu kennen und diese ggf. auszutauschen.

Der Artikel erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit, da vielfältige andere Probleme bei HPLC-Messungen auftreten können.

Um ein vertieftes Wissen für das HPLC-Troubleshooting aufzubauen, ist zum Beispiel ein Besuch von dedizierten Praxiskursen hilfreich, in denen das entsprechende Wissen vermittelt und angewendet wird.

AUTOR
Dr. Christopher Kuhlmann
Produktspezialist HPLC und PPSQ
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg
Tel.: 0203/76 87-0
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www.shimadzu.de