Zum Umgang mit Trennsäule und Eluenten

Troubleshooting in der HPLC

Im täglichen Laboralltag sind lange Standzeiten von Geräten sehr wichtig. Kleine Probleme und Hindernisse müssen schnell aus dem Weg geschafft werden. Das richtige Troubleshooting ist dabei der Schlüssel zur Fehlereingrenzung und -behebung. Auch die richtigen Anzeichen für Probleme bzw. bestimmte Problemursachen zu erkennen ist essenziell.

Die Chromatographie ist keine geheimnisvolle Blackbox, wie es Krimis gern zeigen. Vielmehr müssen zahlreiche Komponenten im Einklang arbeiten und regelmäßig gewartet werden. Verbrauchsteile mit unterschiedlichem Tauschintervall gilt es zu überwachen. Das alles erledigt und plant das Laborpersonal.

Vor allem im Routinelabor mit Hochdurchsatz sind Wartungen vorausschauend anzusetzen, die Auslastung der Geräte immer im Blick. Ausfälle müssen schnell behoben werden, da nicht immer eine Backup-Anlage zur Verfügung steht. Kommt es in der Routine zu Problemen, zählt deren schnelle Behebung, damit die Analysen weiterlaufen können und doppelte Arbeit durch einen erneuten Analyselauf vermieden wird – dies ist besonders wichtig bei sensitiven Proben.

Eins nach dem anderen – Troubleshooting nach Ablaufschema

Das richtige Troubleshooting zur Eingrenzung eines Fehlers ist essenziell, egal, ob durch erfahrene oder unerfahrene Nutzer durchgeführt. Bild 1 zeigt das typische Ablaufschema. Zunächst ist essenziell, das Problem zu erkennen. Dazu ist es wichtig zu wissen, wie sich das System unter normalen Umständen verhält. Typische Parameter einer Methode sind dabei der Rückdruck im System, der Verlauf der Basislinie oder die Retentionszeiten der Analyten.

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Fließschema für das Troubleshooting. © Shimadzu

Durch gezielte Tests lässt sich der Fehler weiter eingrenzen und dann korrigieren. Dabei ist es von Bedeutung, immer nur eine Sache auf einmal zu ändern. Werden sofort viele Parameter modifiziert oder Teile getauscht, fällt es im Nachhinein schwer, die genaue Ursache auszumachen. Gerade für die langfristige Behebung der Fehler ist dieses Wissen entscheidend – ansonsten müsste man wieder von vorne beginnen, bis die HPLC wieder normal läuft. Ausgetauschte defekte Teile sollten sofort entsorgt werden, um zu verhindern, dass sie versehentlich von anderen Kollegen als neu angesehen und verbaut werden, was erneut eine defekte Anlage zur Folge hätte.

Troubleshooting vorbeugen

Es muss nicht zwangsläufig zu Problemen kommen. Für den reibungslosen Betrieb der HPLC lassen sich einige vorbeugende Maßnahmen treffen:

  • Filtrieren:
    Partikel in den Proben können Flusslinien und Säulen verstopfen. Der Gegendruck im System steigt an.
  • Entgasen:
    Vor allem in der analytischen HPLC sind gelöste Gase ein Problem. Sinkt z. B. nach der Säule der Druck, bilden sich eventuell Luftblasen, die Probleme verursachen.
  • Spülen:
    Ein sauberes System kann Schwierigkeiten verhindern. Ausreichende Nadelspülung, Spülschritte in der Methode und eine saubere Umgebung sind das A und O.
  • Temperieren:
    Die Viskosität ist abhängig von der Temperatur, was sich auf den Gegendruck auswirkt. Aber auch die Signalintensität schwankt mit der Temperatur und kann zu falschen Ergebnissen führen.

Kritische Parameter bei der Trennsäule

Mit das Wichtigste im System ist die Trennsäule. Zusammen mit dem Eluenten ist sie das Herzstück einer jeden Analyse. Auf sie ist besonders zu achten, vor allem auf die Trennbedingungen wie pH-Wert, Temperaturbereich und maximaler Druck. Diese Angaben können den Beipackzetteln entnommen oder beim Säulenhersteller erfragt werden.

Vor allem der Druck ist ein kritischer Parameter. Dies ist durch den Herstellungsprozess bedingt: Jede Säule wird mit einem gewissen Gegendruck gepackt. Dieser liegt zwar über dem maximalen Betriebsdruck; doch wird er überschritten, kommt es zur Komprimierung der Säulenpackung. Dies führt zu einem Totvolumen – dann ist keine korrekte Chromatographie mehr möglich. Doch auch Erschütterungen können zu Schäden und Rissen im Trennmaterial führen.

Kommt es doch einmal zu Problemen, müssen sie eingegrenzt werden. Mit zunehmender Erfahrung fällt dies oft leichter. Es gibt einige Anzeichen, die auf bestimmte Probleme hindeuten. Einige lassen sich am Druckprofil erkennen. Daher sollte die Druckkurve immer „mitlaufen“ und Teil der Auswertung sein. Hat der Verlauf z. B. ein „Sägezahn“-Profil, sind sehr wahrscheinlich die Checkvalves (Rückschlagventile) der Pumpen die Verursacher. Mit zunehmender Flussrate erhöht sich die Frequenz der Störung. Zur Behebung können die Checkvalves mit Isopropanol im Ultraschallbad gereinigt werden. Auch das Spülen mit heißem, destilliertem Wasser wirkt oft Wunder. Hilft dies nicht, müssen die defekten Teile durch neue ersetzt werden. Diese Problematik taucht oft in Verbindung mit Acetonitril auf: Die enthaltenen Konservierungsstoffe verhindern die Polymerisierung. Lagern sich diese Substanzen im Checkvalve ab, verkleben sie, und die Kugel im Inneren löst sich erst zeitverzögert.

Kritischer Blick auf die Eluenten

Auch den Eluenten ist besondere Aufmerksamkeit zu schenken. Diese müssen sauber und frei von Partikeln sein. Die Lösungsmittel können leicht verunreinigt werden. Vor allem die Qualität von Wasser ist wichtig. Enthaltene Verunreinigungen werden bei moderaten Bedingungen am Säulenkopf getrappt und können als gaußförmige Peaks eluieren – und sind bei gleichbleibenden Methoden in einer Sequenz sehr retentionszeitstabil. Dies führt zu sich wiederholenden Artefakten aus dem Lösungsmittel, die auch in einem „Blank-Lauf“ feststellbar sind.

Wird zwischen zwei nicht ineinander löslichen Lösungsmitteln gewechselt, muss zwingend ein Mediator wie z. B. Isopropanol zum Zwischenspülen verwendet werden, der mit beiden Lösungsmitteln mischbar ist. Ansonsten kann es zu Schwierigkeiten wie Druckschwankungen kommen.

Bei der Verwendung von Puffern sollte eine Hinterkolbenspülung genutzt werden. Sie verhindert das Auskristallisieren von austretender mobiler Phase. Wird eine neue Methode aufgesetzt, bietet es sich an, die Mischbarkeit mit dem organischen Lösungsmittel zu testen. Bestimmte Kombinationen können bei bestimmten Mischungsverhältnissen ausfallen und zu Verstopfung in den Kapillaren führen. Pufferlösungen sollten niemals im System verbleiben. Es empfehlen sich Standby-Methoden mit einem geringen Fluss oder bei längerem Stillstand das Spülen mit Wasser.

Analytical Intelligence kann helfen

Mit der Weiterentwicklung der HPLC nehmen auch die smarten Funktionen zu, die die Anwender aktiv bei der Fehlervermeidung unterstützen. Mit „Analytical Intelligence“ ausgestattete Systeme haben zum Beispiel automatische Funktionen, die den Nutzern Organisations-, Eingabe- und Abwicklungsarbeiten abnehmen. So haben die LC-40-Systeme von Shimadzu z. B. eine aktive Lösungsmittelüberwachungsfunktion, die mit der Software interagiert und Messungen beendet, bevor die Säule trockenläuft. Die Pumpen erkennen Luftblasen im System, können die Messung stoppen, das System spülen und nach einem Testlauf die Sequenz fortsetzen. Auch das ist zeiteffizient, da keine Batches wiederholt werden müssen.

Auch die Hardware wird immer robuster und so gebaut, dass sie weniger anfällig für Fehler ist. Temperierung der Optik, der Messzelle und des Lampengehäuses gehört zum Standard in den optischen Detektoren und bewirkt eine rauscharme Basislinie.

Fazit

Bereits im Vorfeld helfen vorbeugende Maßnahmen, Probleme in der Chromatographie zu vermeiden. Taucht ein Problem auf, so ist es immer wichtig, nur eine Sache auf einmal zu ändern und die Ruhe zu bewahren. Der Versuch, den Fehler unter Stress und nebenbei zu beheben, ist oft nicht zielführend. Mit dem tieferen Verständnis des Systemverhaltens unter bestimmten Bedingungen wächst die Erfahrung im Troubleshooting. Fehler können schneller identifiziert und behoben werden.

Viele Hersteller von Analysegeräten bieten Troubleshooting-Guides oder Seminare zur Fehlererkennung und -behebung an. Vor allem für Einsteiger ist das eine gute Möglichkeit, tiefer in die Materie einzusteigen. Auch der Rat von erfahrenen Kollegen kann helfen. Doch grundsätzlich gilt: Übung macht den Meister.

AUTOR
Dr. Stefan Vosskötter
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg
info@shimadzu.de
www.shimadzu.de

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