Einfluss von Oberflächen im UPLC-System auf die Analytik

LC-MS/MS-Analyse von B-Vitaminen

Die Autoren zeigen die Ergebnisse einer Studie zur Analyse von B-Vitaminen, bei denen zur Auftrennung der Analyten UPLC-Systeme mit verschiedenen Oberflächen innerhalb des chromatographischen Systems eingesetzt wurden: Edelstahl und ein spezielles Siloxanmaterial.

© harunyigit/stock.adobe.com

B-Vitamine sind wasserlösliche Vitamine, die für normale menschliche Stoffwechsel- und physiologische Funktionen unerlässlich sind. Die routinemäßige Analyse von B-Vitaminen ist ein wichtiges Verfahren in der Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, Getränken und Nahrungsmittelzusätzen sowie für die Ernährungsforschung. Die Bestimmung mittels Flüssigchromatographie und Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) ist dabei Standard. Bild 1 zeigt die Strukturen der B-Vitamine und ihrer bioaktiven Vitamere, die in unserer Studie untersucht wurden. Einige von ihnen, z. B. die Phosphate, haben komplexbildende Eigenschaften und wechselwirken mit Metallen, was problematisch für die Analytik sein kann.

In UPLC-Systemen hat der innere Strömungsweg, der aus Metall besteht, eine wesentlich kleinere Oberfläche als das Packungsmaterial der Chromatographiesäule. Trotzdem sollte der Strömungspfad nicht als potenzielle Quelle unerwünschter Wechselwirkungen, z. B. Adsorption, mit Zielanalyten übersehen werden. Bei der Analyse wird dies durch eine schlechte Peakform oder sogar einem reduzierten bzw. keinem Signal und ungenauen Ergebnissen sichtbar [1, 2]. Es gibt verschiedene Möglichkeiten, diese Probleme zu umgehen, wie z. B. das Ersetzen des Edelstahlmaterials durch andere Materialien, die Verwendung von Additiven in den mobilen Phasen, um die Wechselwirkungen zu stören, oder die Passivierung der Oberfläche vor der Analyse. Diese Verfahren haben ihre Einschränkungen [3] und können sich negativ auf die Chromatographie und die analytische Produktivität auswirken.

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Bild 1: Strukturen der B-Vitamine und ihrer Vitamere. © Waters

Aus diesem Grund wurde bei Waters mit den „MaxPeak“ High Performance Surfaces (HPS) eine Technologie entwickelt, um Analytinteraktionen mit Metalloberflächen zu mindern. Die Maxpeak-HPS bestehen aus einer hoch vernetzten Schicht aus ethylenverbrücktem Siloxanmaterial, das dem von BEH-Partikeln ähnelt [3] und bei der LC-Analytik von organischen Säuren, Organophosphaten, Oligonukleotiden, Peptiden, Glykanen und Phospholipiden wesentliche Verbesserungen brachte [4 – 7]. (Produkte, in denen Maxpeak-HPS verwendet werden, sind mit dem Zusatz Premier gekennzeichnet.) Im folgenden Artikel wird der Einfluss eines Acquity Premier LC-Systems und einer Premier-Säule auf die LC-MS/MS-Bestimmung von B-Vitaminen beschrieben.

Aufbau der Vergleichsstudie

Den LC-Bedingungen wurde die AOAC Official Method 2015.14 zur Bestimmung der Gesamtvitamine B1, B2, B3 und B6 in Säuglingsanfangsnahrung und verwandten Nährstoffen [8] zu Grunde gelegt. In der Vergleichsstudie wurden insgesamt 18 Verbindungen, einschließlich der Vitamine B5, B9, B12 und Biotin, analysiert. Um die Auswirkung der Analyt-Metall-Interaktion und die Wirkungsweise der Maxpeak-HPS deutlich zu machen, wurden zwei LC-Setups miteinander verglichen. Setup 1 bestehend aus einem Acquity Premier System und einer Acquity Premier BEH C18 (1,7 μm, 2,1 x 100 mm) Säule – Premier-Setup genannt – und Setup 2 bestehend aus einer Acquity UPLC H-Class Plus und einer Acquity UPLC BEH C18 (1,7 μm, 2,1 x 100 mm)-Säule – Standard-Setup genannt. Während im Standard-Setup herkömmliche Edelstahlteile verwendet wurden, ist im Premier-Setup Maxpeak-HPS implementiert. Beide LC-Setups wurden mit demselben Xevo TQ-S micro MS-System gekoppelt, um instrumentelle Variablen in der Vergleichsstudie zu minimieren.

Siloxanmaterial vs. Edelstahl

Für die Mehrheit der 18 Vitamine wurden mit dem Premier-Setup größere Peakhöhen und Peakflächen beobachtet. In Bild 2 zeigen Balkendiagramme den Peakfächenvergleich zwischen Premier- und Standard-Setup von sieben Wieder-holinjektionen eines 1-μg/ml-Standardmixes. Für die Beurteilung der Daten ist relevant, dass die Systeme und Säulen neu waren und zuvor keine B-Vitamine in die Systeme injiziert wurden. Der Vergleich macht deutlich, dass mit dem Premier-Setup für alle Verbindungen größere oder identische Peakflächen erzielt wurden. Dabei zeigt sich, dass die Analyte unterschiedlich stark mit der Metalloberfläche des Standard-Setups wechselwirken. Deutlich größere Werte für die Peakhöhen und Peakflächen zeigten sich bei Verwendung des Premier-Setups für Flavinmononukleotid (FMN), Thiamin, Pyridoxal-5‘-phosphat (PLP) und Pantothensäure (Bild 2). Die Detektion von Thiaminpyrophosphat (TPP) wird überhaupt erst mit dem Premier-Setup möglich.

Bild 2: Vergleich der Analyse von B-Vitaminen und deren Vitameren mit dem Premier-Setup und dem Standard-Setup. Gegenüberstellung der Peakflächen auf dem Standard-Setup (blauer Balken) und dem Premier-Setup (oranger Balken). © Waters

Der Vergleich der Chromatogramme der ersten Injektionen von FMN, Thiamin, PLP und Pantothensäure in Standardlösung auf beiden LC-Systemen zeigt die wesentliche Verbesserung von Peakhöhe und Response im Premier-Setup (Bild 3). Zusätzlich wurden für Thiamin- und PLP im Premier-Setup schmalere Peaks und weniger Tailing beobachtet. Die Zunahme der Peakfläche bei der LC-MS/MS-Analyse von B-Vitaminen mit dem Premier-Setup zeigte sich auch nach längerer Verwendung (Daten nicht gezeigt). Im Vergleich zum Standard-Setup hat sich für keines der B-Vitamine eine Verschlechterung der Chromatographie mit dem Premier-Setup ergeben.

Bild 3: Die Peakhöhen waren mit der Maxpeak HPS-Technologie deutlich höher. Vergleich der LC-MS/MS-Chromatogramme von FMN, Thiamin, PLP und Pantothensäure mit Premier- und Standard-Setups. Die Peakintensitäten des Premier-Setups (grüne Linie) sind auf 100% gesetzt, die des Standard-Setups (blau-gefüllte Peaks, rote Linie) dem Verhältnis entsprechend dargestellt. © Waters

Die größeren Peakflächen auf dem Premier-Setup führen zu höherer Empfindlichkeit in der LC-MS/MS-Analyse der B-Vitamine. Direkt im Anschluss an die Wiederholinjektionen des 1-µg/ml-Standardmixes wurde eine Standardreihe mit Konzentrationen zwischen 3 ng/ml und 10 μg/ml auf beiden LC-Setups injiziert. Anhand der Ergebnisse der Standardreihe wurden die Quantifizierungsgrenzen (LOQ) der B-Vitamine auf beiden LC-Systemkonfigurationen abgeschätzt. Eine Verbesserung des LOQ um Faktor 3 – 10 wurde auf dem Premier-Setup für FMN, Thiamin, PLP und Pantothensäure erreicht (s. Tabelle).

© Waters

Die HPS-Technologie minimiert die Wechselwirkungen zwischen den B-Vitaminen und der inneren metallischen Oberflächen des Fließweges in LC-System und -Säule. Damit reduziert sich ebenfalls das Risiko einer Verschleppung, das häufig bei der LC-Analyse von B-Vitaminen zu beobachten ist. In Bild 4 sind LC-MS/MS-Chromatogramme von vier B-Vitaminen im Vergleich gezeigt, die Blankinjektionen auf dem Standard- und dem Premier-Setup direkt nach der Injektion des höchsten Standards der Kalibrierreihe (10 µg/ml) zeigen. Verschleppung von 0,03 – 0,1 % wurden für Riboflavin, Pyridoxal, 5-Methyltetrahydrofolat und Methylcobalamin ausschließlich in der Blankinjektion auf dem Standard-Setup gefunden, während die Blankinjektion auf dem Premier-Setup keine Peaks zeigt. Die Maxpeak HPS-Technologie reduziert folglich das Risiko von Verschleppungen bei der LC-MS/MS-Analyse von B-Vitaminen.

Fazit

Bild 4: LC-MS/MS-Chromatogramme von Blankinjektionen, die direkt auf eine 10-µg/ml-Standardinjektion folgten. Premier-Setup (A), Standard-Setup (B) und 10µg/ml Standardlösung (C). Carry-Over zwischen 0,03–0,1% wurde bei den vier B-Vitaminen Riboflavin, Pyridoxal, 5-Methyl-THF und Methylcobalamin mit dem Standard-Systemaufbau (B) detektiert. Mit dem Premier-Setup (A) wurde keine Verschleppung beobachtet. © Waters

Der direkte Vergleich zwischen dem Premier-Setup mit Acquity Premier System und Acquity Premier BEH C18-Säule und dem Standard-Setup mit Acquity UPLC H-Class Plus und einer Acquity UPLC BEH C18-Säule zeigte deutliche Verbesserungen bei der Bestimmung von B-Vitaminen mit LC-MS/MS. Dazu gehören schärfere und symmetrischere Peakformen, größere Peakhöhen und -flächen, höhere Empfindlichkeit, ein vermindertes Risiko für Carry-Over und die Möglichkeit, Thiaminpyrophosphat in die Analyse zu integrieren. Diese Punkte können helfen, B-Vitamine in niedrigeren Konzentrationen mit höherer Genauigkeit und Präzision sowie mehr Zuverlässigkeit zu quantifizieren. Damit bietet der Premier-Setup mit Maxpeak HPS Technologie eine geeignetere Lösung für die Analyse von Vitaminen der B-Gruppe.

AUTOREN
Dr. Claudia Rathmann
Waters GmbH, Eschborn
Dr. Jinchuan Yang, Paul D. Rainville
Waters Corporation, Milford, MA, USA
www.waters.com

Referenzen

[1] Wakamatsu, A.; Morimoto, K.; Shimizu, M.; Kudoh, S. A Severe Peak Tailing of Phosphate Compounds Caused by Interaction with Stainless Steel Used for Liquid Chromatography and Electrospray Mass Spectrometry. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1823–1830.

[2] Asakawa, Y.; Tokida, N.; Ozawa, C.; Ishiba, M.; Tagaya, O.; Asakawa, N. Suppression Effects of Carbonate on the Interaction between Stainless Steel and Phosphate Groups of Phosphate Compounds in High-Performance Liquid Chromatography and Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Chromatogr. A, 2008, 1198–1199, 80–86.

[3] Lauber, M.; Walter, T. H.; DeLano, M.; Gilar, M.; Boissel, C.; Smith, K.; Birdsall, R.; Rainville, P.; Belanger, J.; Wyndham, K. Low Adsorption HPLC Columns Based on MaxPeak High Performance Surfaces. Waters White Paper, 720006930EN, 2020.

[4] Birdsall, R. E.; Kellet J.; Ippoliti, S.; Ranbaduge, N.; Shion, H.; Yu, Y. Q. Increasing Chromatographic Performance of Acidic Peptides in RPLC-MS-based Assays with ACQUITY PREMIER featuring MaxPeak HPS Technology. Waters Application Note, 720007003EN, 2020.

[5] Boissel, C.; Walter, T. H. Improved Peak Shape and Wide Selectivity Range with ACQUITY PREMIER Columns. Waters Application Note, 720007014EN, 2020.

[6] Smith, K. M. and Rainville, P. Utilization of MaxPeak High Performance Surfaces for Improved Separation and Recovery of Analytes Associated with the Tricarboxylic Acid Cycle. Waters Application Note, 720006727EN, 2020.

[7] Brennan, K.; Lame, M. L.; Donegan, M.; Rainville, P. D. Improved Oligonucleotide SPE-LC-MS Analysis Using MaxPeak High Performance Technology. Waters Application Note, 720007019EN, 2020.

[8] Official Methods of Analysis (2019) 21st Ed., AOAC INTERNATIONAL, Rockville, MD, Method 2015.14. www.eoma.aoac.org [accessed on June 19, 2020].

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