Der unaufhaltsame Trend zu kleineren LC-Trennpartikeln hat nicht nur die chromatographische Auflösung verbessert, sondern auch die Analysenzeiten verkürzt. Voraussetzung dafür war allerdings eine Hardware, die trotz enormen Rückdrucks dieser extrem dichten Packungen einen konstanten Fluss erzeugen konnte. Die Fortschritte bei der Hardware-Entwicklung (Druckbereiche über 1 000 bar bei 3 ml/min) haben wiederum weitere Verbesserungen bei der Säulentechnologie in Gang gebracht, so dass heute Hochleistungssäulen mit Ultra-Hochdrucksystemen für die Routineanalytik zur Verfügung stehen. Diese Technik firmiert unter der Bezeichnung UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography), wobei das P schon lange nicht mehr für Pressure steht, sondern die Leistung in den Vordergrund stellt.

Daran beteiligt sind in erster Linie alle Verbindungskapillaren, wobei deren Länge proportional, deren Innendurchmesser aber überproportional an der Dispersion beteiligt sind. Weiterhin spielen alle Verbindungskomponenten (Unions, Fittings, T-Stücke etc.) sowie sämtliche Ventile, aber auch Detektoren mit ihren Einlass-Wärmetauschern und Durchflusszellen (Volumen und Geometrie), eine Rolle. Besonders gefürchtet ist die Dispersion durch diese sog. „Extra-Column Volumen“ (ECV) nach der Trennsäule, da die aufwändig erzielte chromatographische Auftrennung dadurch zum Teil wieder unnötig vergeudet wird.

Auflösungsverschlechterung durch Dispersion infolge eines einzelnen nicht totvolumenfreien Kapillaranschlusses (oben). © Agilent Technologies

Grundsätzlich sollten alle Leitungen so kurz wie möglich gehalten werden und nicht unbedingt notwendige Verbindungsstücke, Verzweigungen, Ventile, Inline-Filter etc. überhaupt vermieden werden.

Das gilt ganz besonders für den Probenweg nach der Trennsäule, wo noch strikter darauf geachtet werden muss, dass insbesondere die Innendurchmesser der Kapillaren entsprechend der Effizienz der Trennsäulen minimiert werden. Die LC-Hersteller bieten Stahlkapillaren unterschiedlicher Innendurchmesser (meist farblich kodiert) mit passenden Verschraubungen vorkonfektioniert in unterschiedlichen Längen an.

Totvolumen ausschließen

Dispersionseffekte durch notwendige Verbindungskapillaren etc. sind nicht immer vollständig vermeidbar, da jede Leitung und jeder Anschluss etwas dazu beitragen. Was aber unbedingt verhindert werden muss, sind Totvolumen bei jeder einzelnen Verschraubung. Und ein LC-System besteht aus vielen Komponenten, die alle mit je zwei Schnittstellen verbunden sind.

Bei Kapillarverbindungen ist als erstes streng darauf zu achten, dass das jeweils exakt dazu passende Anschlusssystem verwendet wird. Die HPLC-Hersteller haben sich leider nicht darauf geeinigt, ein einheitliches Verbindungssystem zu entwickeln, sondern es existieren mindestens eine Hand voll unterschiedlicher LC-Fittings, die nicht oder nur teilweise untereinander kompatibel sind (Swagelok, Parker, Valco, Waters, Rheodyne etc.). Leider unterscheiden sich manche nicht so gravierend, dass sie gar nicht ineinander passen würden. So kommt es nicht selten vor, dass unterschiedliche Systemkomponenten versehentlich miteinander kombiniert werden und mit entsprechendem Kraftaufwand sogar halbwegs dicht werden. Die dabei entstehenden Leerstellen (Totvolumen wie in Bild 1 unten, rot) wirken sich allerdings fatal auf die Auflösung aus.

Auch ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Kapillare unbedingt bis zum Anschluss in die Bohrung geschoben werden muss (Bild 1, oben) und beim Festziehen der Verschraubungen diese Position gehalten wird.

Wenn eine Kapillare die Bohrung nicht vollständig ausfüllt, entsteht durch das gefürchtete Totvolumen (Bild 1 unten, rot) eine Durchmischung und damit Peakverbreiterung, was gleichbedeutend ist mit einer Verschwendung von Auflösungsvermögen (Bild 2, oben). Abgesehen von der auftretenden Retentionszeitverschiebung schwinden außerdem noch die Peak-Höhen und damit die Nachweisstärke.

Vom Injektor bis zum Detektor

Auch Einflussgrößen vor der Trennsäule sind an der Gesamtleistung des Systems beteiligt. Die Anfangsstartbande bei der Probenaufgabe, das heißt das Injektionsvolumen, muss auf die Kapazität und Trennleistung der HPLC-Säule abgestimmt werden.

Maximal 15  % des Peak-Volumens sind ein üblicher Richtwert für das Injektionsvolumen, aber auch nur dann zulässig, wenn die Probe weniger oder gleich viel organischen Anteil (Methanol, Acetonitril etc.) besitzt, wie das Laufmittel. Ist die Probe unpolarer als die Lösungsmittel-Zusammensetzung am Beginn der Reversed-Phase-Chromatographie, muss das Aufgabevolumen nochmals reduziert werden, um weitere Effizienzverluste zu vermeiden.

Diodenarray-Detektor mit hochsensitiver Totalreflexions-Lichtleiterzelle (Ausschnittsvergrößerungen). © Agilent Technologies

Kann die Dispersion des gesamten Systems bis zum Detektor angemessen gering gehalten werden, dann darf sie keinesfalls im Detektor selbst verschlechtert werden. Deshalb sind die Hersteller z. B. bei optischen Detektoren (DAD Diodenarray-Detektor) technologisch neue Wege gegangen, um den Hochleistungs-Trennsäulen gerecht zu werden. Bisher hatte man für hohe Sensitivität relativ große Detektorzellen verwenden müssen, um die notwendigen langen Strahlengänge zu realisieren. Deren internes Volumen und damit die unerwünschte Dispersion waren allerdings für „Sub-2 Micron“-Hochleistungssäulen viel zu groß. Eine simple Verkürzung des Strahlenganges hätte aber andererseits die Messempfindlichkeit zu sehr geschwächt.

Daher wurden auf der technischen Basis der Fused Silica-Materialien sehr enge optische Lichtleiter mit innerer Totalreflexion (TIR) entwickelt (Bild 3). So konnten hohe Licht-Transmissionen mit kleinsten Zellvolumen (z. B. 2,3  µl inkl. Zu-und Ableitungen) kombiniert werden und damit höchste Sensitivitäten bei vernachlässigbarer Dispersion erzielt werden.

Datenrate beachten

Für viele Anwender überraschend, stellen sich die Datenaufnahme-Parameter am Ende der Analyse als unterschätzte Gefahr für die chromatographische Auflösung heraus. Als Abtastfrequenz bei der Analog/Digital-Wandlung des Detektorsignals hat sie einen unmittelbaren Einfluss auf die Peakbreite und muss folglich unbedingt auf die chromatographische Trennleistung abgestimmt werden. Was oftmals unterschätzt wird, ist in Bild 4 anhand einer sehr schnellen Trennung mittels 1,8 µm-Material mit mehrfacher Verdoppelung der Datenrate von 5 - 80 Hz dargestellt.

Erst bei der höchsten Frequenz kommt die Überlegenheit der Kombination aus optimierter Trennung mittels Hochleistungssäule und moderner Hardware-Technik (UHPLC mit minimiertem ECV) vollständig zum Tragen. Es wäre im höchsten Maße verschwenderisch, wenn Substanzen mit großem technischen Aufwand bestmöglich separiert werden, um sie dann aus Unverständnis oder gar Ignoranz elektronisch wieder „zusammen-zu-mitteln“.

Um Missverständnissen vorzubeugen: hier ist nicht der notwendige Kompromiss gemeint, der in der Massenspektrometrie oft zu Gunsten der Nachweisempfindlichkeit eingegangen werden muss. In der LC-MS/MS muss die verfügbare Messzeit systembedingt zwischen der Anzahl von Messpunkten und der für die Sensitivität so wichtigen Verweilzeit (Dwell Time) aufgeteilt werden. Auf Kosten einer präzisen Abtastung der Peakform und folglich zu Ungunsten der Reproduzierbarkeit ist man bei dieser Technik gezwungen, mit 10 - 15 Datenpunkten pro Peak auszukommen, obwohl ca. 20 – 30 Punkte ideal wären.

Wesentlich komfortabler ist die Situation in der klassischen HPLC mit dem weit verbreiteten UV/VIS-Universaldetektor DAD (wie in Bild 3). Nicht nur, dass eine hohe Frequenz des Auslesens von kompletten Diodenarray-Datensätzen praktisch keinen Einfluss auf die Messempfindlichkeit hat, werden zugleich auch jeweils komplette Spektren gewonnen. Das kostet lediglich etwas mehr Speicherplatz auf der Festplatte, was aber bei der heutigen Computertechnik kein Thema mehr ist.

Auswirkungen sinkender Datenraten (Hz) auf die Peakbreite (PW) und damit Trenneffizienz einer schnellen UHPLC-Trennung (DAD). © Agilent Technologies

Darüber hinaus ermöglichen die lückenlosen Vollspektren-Aufzeichnungen jederzeit die Peak-Reinheit spektral zu überprüfen, Dekonvolutionen durchzuführen und Spektrenvergleiche anzustellen.

Einige Läufe mit steigender Datenrate zeigen durch Vergleich der Peakbreiten sehr schnell die notwendige Frequenz an. Oder man nimmt nur einen Lauf mit höchster Frequenz auf und fasst dann am Datensystem durch sog. Bunching-Faktoren mehrere Datenpunkte zusammen und vergleicht die resultierenden Auflösungen. Im Zweifelsfall sollte man sich immer für die etwas höhere Frequenz entscheiden.

Fazit

Mit der zunehmenden Trennleistung von immer kleineren UHPLC-Partikeln spielen Dispersionsbeiträge vor und insbesondere nach der Trennsäule eine immer wichtigere Rolle. Nur die konsequente Minimierung des Extra-Column-Volumens durch Ausschluss von Totvolumen und Reduktion von Länge und Innendurchmesser bei Verbindungskapillaren auf das absolut Notwendigste, verhindert derzeit das Verschenken von wertvoller Trenneffizienz. Eine zu niedrig gewählte Datenrate wird auch zukünftig der unnötigste, aber auch am einfachsten zu korrigierende Verschwendungsfehler bleiben.

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik, A-Linz