Fettlösliche Vitamine auftrennen

Was ist drin im Vitamincocktail?

Die Autoren von Waters beschreiben ein chromatographisches System, welches überkritisches CO2 als mobile Phase nutzt, und dessen Anwendung zur Trennung fettlöslicher Vitamine und Carotine.
Bildquelle: Waters

Der Trend, sich gesund zu ernähren, um chronischen Krankheiten vorzubeugen und die eigene Lebensqualität zu erhöhen, ist unaufhaltsam. Vitamine spielen dabei eine große Rolle. Zu den fettlöslichen Vitaminen (FSVs) gehören die Vitamine A, D, E und K. Sie sind an Stoffwechselreaktionen im Zusammenhang mit wichtigen biologischen Funktionen beteiligt und können, wie Vitamin A und D, vom Körper selbst synthetisiert oder müssen, wie Vitamin E und K, zwingend zugeführt werden. Um uns die Aufnahme und Dosierung zu erleichtern, sind FSVs in speziellen Präparaten und als Nahrungsergänzungsmittel in vielen tagtäglichen Lebensmitteln enthalten. Die Qualitätsüberwachung dieser Produkte ist essenziell, stellt aber, aufgrund der Anzahl und Variabilität der Vitamine und nicht zuletzt wegen der komplexen Zusammensetzung vieler Darreichungsformen, das analytische Labor vor eine große Herausforderung.

Derzeit werden die meisten analytischen FSV-Trennungen unter Verwendung von Flüssigkeitschromatographie (LC), und zwar sowohl mit Umkehrphasen (RP)- als auch mit Normalphasen (NP)-LC, durchgeführt. Die „ACQUITY UltraPerformance Convergence ChromatographyTM“ (UPC2) von Waters vereint RP-und NP-Charakteristika und ist das Pendant zur „ACQUITY UPLC“ für Superkritische Flüssigchromatographie (SFC). Sie ist aufgrund ihrer Geschwindigkeit und Nachhaltigkeit eine wertvolle Alternative für die schnelle FSV-Analyse. In ihrem Review „Advanced analytical techniques for fat-soluble vitamin analysis” beschreiben Fanali et al. [1] das Potenzial der SFC folgendermaßen: “SFC is a separative technique which, integrating characteristics of gas-chromatography (GC) and LC, exhibits an excellent selectivity for separating non-polar and moderate-polar compounds such as fat-soluble organic micronutrients.” Im Folgenden stellen wir „UPC2“-Technik am Beispiel der Trennung von sieben fettlöslichen Vitaminen (FSVs) und zwei Carotinen vor.

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Doch bevor wir auf die Anwendung in der FSV-Analytik eingehen, möchten wir einen eher generellen Aspekt beleuchten, der bereits mit der Entwicklung der UPLC an Bedeutung gewonnen hat: der verantwortungsbewusste Einsatz von Lösungsmitteln. Der Verbrauch an umweltschädlichen Lösungsmitteln kann durch die Verwendung von stationären Phasen mit < 2 µm-Partikeln stark reduziert werden und im Labor Einkaufs- und Entsorgungskosten sparen. CO2 kann aus Industrieabfällen gewonnen und wiederverwendet werden. Aus diesem Grund wird SFC auch häufig als grüne Chromatographie bezeichnet.

Funktionsweise der „UPC2

Als mobile Phase dient überkritisches CO2, das bei 31,1 °C und 73,8 bar in diesen Aggregatzustand übergeht und sich sowohl wie ein Gas als auch wie eine Flüssigkeit verhält. Bei der UPC2 ist die Kombination aus der niedrigen Viskosität von Gasen, die eine hohe Diffusionsfähigkeit bewirkt, und der hohen Dichte von Flüssigkeiten, die für gute Lösungsmitteleigenschaften sorgt, entscheidend. Bei identischer Trennleistung sind mit UPC2, im Vergleich zu NP- und RPLC, stark verkürzte Analysenzeiten möglich. Fanali et al. nennen in ihrem Review dafür als Beispiel Vitamin E. Die zitierten UPC2-Methoden erzielen eine vollständige Trennung der acht Tocochromanole in Laufzeiten zwischen 30 s und 5,5 min. Diese sind verglichen mit typischen Analysenzeiten von 20 min mit NPLC sehr kurz.

Bild 1: Bestandteile und Funktionsweise des „ACQUITY UPC2“-Systems. © Waters

Bleiben wir bei den Eigenschaften der UPCund betrachten deren weitreichenden Selektivitätsbereich näher. Dieser deckt sowohl NP- als auch RP-LC, bei denen komplementäre mobile und stationäre Phasen eingesetzt werden, ab. Überkritisches COist vergleichbar mit klassischen NPLC-Eluenten, wie Hexan oder Toluol. Durch die Zugabe von Modifiern, wie Acetonitril (ACN) oder Methanol, die sich am anderen Ende der elutropen Reihe befinden, können auch RP-Bedingungen erzeugt werden. Damit hat die UPCnicht nur bei der Laufzeit, sondern auch bei den Anwendungsmöglichkeiten durchaus Vorteile gegenüber den altbewährten Chromatographietechniken.

Der Aufbau der UPCunterscheidet sich von den klassischen UPLC-Systemen im Wesentlichen durch das Vorhandensein einer speziellen binären Pumpe für flüssiges COund Modifier, sowie dem sogenannten Convergence Manager, dem Herzstück der Anlage. Er sorgt mit zwei Rückdruckventilen, einem statischen und einem aktiv gesteuerten, für eine äußerst genaue und reproduzierbare Regulierung des Rückdrucks, der das COim überkritischen Zustand hält. Dies ist essenziell für robuste chromatographische Methoden, da geringe Schwankungen des Rückdrucks sich sofort auf die Retentionszeiten der Analyten auswirken würden. Außerdem beherbergt der Convergence Manager ein zusätzliches Injektionsventil, das mit dem Autosampler abgestimmt ist und so die Probe präzise und reproduzierbar in das System injiziert. In Bild 1 ist dieser Aufbau schematisch dargestellt und erklärt.

Bild 2: Chemische Strukturen und logP-Werte der in dieser Studie verwendeten FSVs. Bild: Waters

Vitamin- und Carotinmischung trennen

Die eingangs erwähnte Methode zur FSV-Bestimmung umfasst sieben Vitamine, Retinylacetat (Vitamin A Acetat), Retinylpalmitat (Vitamin A-Palmitat), Alpha-Tocopherol (Vitamin E), Alpha-Tocopherylacetat (Vitamin E-Acetat), Ergocalciferol (Vitamin D2), Vitamin K1, Vitamin K2 (MK-4) und zwei Carotine: Lycopin und ß-Carotin (Bild 2). Sehr häufig werden die Substanzen aus diesem Vitamin-Cocktail in Einzelmethoden analysiert. Der Anspruch bei der Methodenentwicklung war es, eine robuste und schnelle Analytik für alle neun Verbindungen aufzusetzen. Dabei waren zwei Kriterien herausfordernd: zum einen die Trennung der Vitamine K1 und K2 und zum anderen die Integration der Carotine. In Tests mit zahlreichen analytischen Säulen und möglichen Modifiern zeigte sich, dass die Kombination aus Viridis HSS C18-Säule und Acetonitril als Modifier als Einzige die Trennung zwischen dem kritischen Paar Vitamin K1 und K2 meisterte und nur vier Minuten Laufzeit beanspruchte (s. Bild 3). Um die Selektivität zwischen K1 und K2 zu verbessern, wurde eine relativ niedrige Säulentemperatur von 30 °C gewählt, die außerdem einen möglichen Abbau der Carotine aufgrund ihrer hohen Oxidationsanfälligkeit minimieren sollte.

Bild 3: UPC2/UV-Chromatogramme von sieben fettlöslichen Vitaminen und zwei Carotinen; Overlay aus sechs Wiederholinjektionen. Bild: Waters

Die sieben Vitamine im Analytmix eluierten mit einem niedrigen Anteil ACN (2 %) in der mobilen Phase, wohingegen die beiden Carotine einen viel höheren Anteil an ACN (20 %) für die Elution von der Säule erforderten. Diese Beobachtung kann mit den Molekülstrukturen und der sich daraus ergebenden Interaktion mit der mobilen bzw. stationären Phase erklärt werden. Während der in allen FSVs vorhandene lipophile Teil mit dem unpolaren COwechselwirkt, induzieren die Carbonyl- oder Hydroxylgruppen der sieben Vitamine zusätzliche polare Wechselwirkungen mit dem Modifier Acetonitril, wodurch die Retentionszeit reduziert wird. Die beiden Carotine hingegen enthalten keine Heteroatome im Molekül und bilden eher starke Wechselwirkungen mit den unpolaren C18-Ketten der stationären Phase, was zu einer längeren Retentionszeit führt.

Um die Reproduzierbarkeit der Methode zu testen, wurden sechs Wiederholinjektionen für die neun Analyten durchgeführt, wie in Bild 3 dargestellt. Die relativen Standardabweichungen (RSDs) für die Retentionszeiten liegen unter 0,25 %. Bei sieben der neun Analyte wurden für die Peakfläche RSDs von weniger als ein Prozent erreicht (n = 6). Vitamin A-Acetat eluiert als erstes von der Säule, weshalb sich der leicht erhöhte RSD von 2,7 % wahrscheinlich auf die ansteigende Basislinie zurückführen lässt, die mit der Injektionssequenz verbunden ist.

Schlussbetrachtung

UPCist, obwohl weithin als Normalphasentrenntechnik eingesetzt, auch für die Trennung von unpolaren Analyten geeignet. Überkritisches CO2, als mobile Phase, ist nicht nur mit den organischen Lösungsmitteln mischbar, die während der Probenvorbereitung verwendet werden, sondern ist auch ein gutes Lösungsmittel für unpolare Analyten. Die geringe Polarität von COfördert unpolare Wechselwirkungen zwischen Analyten und der mobilen Phase. Dies resultiert in weniger Retention und damit schnellerer Laufzeit. Das Beispiel der Methodenentwicklung zur Trennung von neun fettlöslichen Analyten – sieben Vitaminen und zwei Carotinen – zeigt das analytische Potenzial der UPC2 in Bezug auf Laufzeit, Robustheit und Reproduzierbarkeit von sowohl Retentionszeit als auch Peakfläche. 

Referenzen:

[1] Fanali et al.: Advanced analytical techniques for fat-soluble vitamin analysis, Trends in Analytical Chemistry, Volume 87, February 2017, Pages 82-97
[2] Waters App Note: A Single-Injection UPC2 Method for Fast and Simultaneous Separation of Nine Fat-Soluble Vitamins, www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720004551en.pdf

Weitere Informationen unter: www.waters.com/foodenviro2020 (virtueller Workshop zur Trenntechnik)
#AnalyticalFoodies

AUTOREN
Dr. Claudia Rathmann, Dr. Tobias Langrock
Waters GmbH, Eschborn
deutschland@waters.com
www.waters.com

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