Glyphosat & Co.

Fünf Gründe, warum die direkte Analyse in Lebensmitteln ein Kinderspiel ist

Mit zwei neu entwickelten Methoden zur Bestimmung von polaren anionischen Pestiziden können Glyphosat und Co. einfach und zuverlässig nachgewiesen werden.

Polare anionische Pflanzenschutzmittel sind eine besondere analytische Herausforderung. © Waters

Die anhaltende öffentliche Debatte über die potenzielle Gefährdung von Mensch und Umwelt durch das Totalherbizid Glyphosat hat in den letzten Jahren zu einer erhöhten Sensibilisierung bei Verbrauchern und steigenden Analysenzahlen bei Lebensmittellaboren geführt. Die physico-chemischen Eigenschaften von Glyphosat und anderen Vertretern der polaren anionischen Pflanzenschutzmittel machen die Bestimmung dieser Substanzen zu einer analytischen Herausforderung. Mit der hier beschriebenen neuen chromatographischen Lösung können Glyphosat und eine Auswahl der wichtigsten polaren anionischen Pestizide und Wachstumsregulatoren sowie deren Transformationsprodukte von der Liste der analytischen Problemkandidaten gestrichen werden. 

Der traditionelle Ansatz einer Einzelmethode mit aufwändiger Probenvorbereitung (FMOC-Derivatisierung) wurde bereits durch die EURL Quick Polar Pesticides (QuPPe) Methoden vereinfacht, in denen die direkte Analyse in ersten Multimethoden beschrieben ist. Deren Routinetauglichkeit bietet im Hinblick auf Robustheit, Sensitivität und unkomplizierter Anwendung durchaus Optimierungspotenzial. Dieser Aufgabe haben sich die Methodenentwickler bei Waters angenommen. Nach einigen Evolutionsstufen wurde im letzten Jahr eine ganzheitliche Lösung für die herausfordernde Applikation veröffentlicht, die aktuell in verschiedenen europäischen Laboren erfolgreich läuft.

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Bild 1: Chromatogramm von AMPA (Retentionszeit 1,69 min in Methode B) mit Indikation des Säulentotvolumens t0 in blau (0,48 min: ergibt sich aus Säulendimension und Flussrate). Vorgabe der minimalen Retentionszeit 2 x t0 laut SANTE Richtlinie (0,96 min) in orange. © Waters

Was macht die Applikation so besonders?

Grund 1: Die Chromatographie. Ein Hauptaugenmerk bei der Entwicklung und Validierung von LC-MS/MS-Methoden für die Lebensmittelanalytik ist die Einhaltung der SANTE-Richtlinien. Gerade die Vorgabe zur minimalen Retentionszeit, die das zweifache des Säulentotvolumens betragen soll, ist für hochpolare Analyte mit herkömmlichen RP-stationären Phasen ohne zusätzliche Derivatisierung nicht erreichbar (Bild 1).

Bild 2: Stabilität der Retentionszeit innerhalb von 37 aufeinanderfolgenden Injektionen für Glyphosat, dotiert in Tomatenextrakt (orange Linie) und Weizenmehlextrakt (olivgrüne Linie). Der laut SANTE zulässige Toleranzbereich von ± 0,1 min ist mit den weinroten Linien gekennzeichnet. (Bild: Waters) © Waters

Neben der Retention spielen aber aufgrund der komplexen Matrizes, die untersucht werden müssen, auch die Peakform und die Stabilität der Retentionszeit (Bild 2) eine entscheidende Rolle für die Robustheit einer Multimethode für polare Pestizide. Zusätzlich wird in den QuPPe-Methoden auf die notwendige chromatographische Trennung verschiedener kritischer Paare hingewiesen, um eine falsch-positive Identifizierung zu vermeiden (Bild 3). Zudem können natürlich vorkommende Matrixkomponenten, wie die Äpfelsäure, die bei der Probenvorbereitung nicht abgetrennt werden, aufgrund ihrer um drei Größenordnungen höheren Konzentration eine Suppression des Signals verursachen. Aus diesem Grund muss hierfür ebenfalls eine chromatographische Trennung gewährleistet sein.

Bild 3: Basislinien-getrennte Peaks der in QuPPe beschriebenen kritischen Paarung AMPA, Fosetyl-Al und Phosphonsäure, so dass falsch-positive Identifizierung oder Überbefunde ausgeschlossen sind. Im blauen Kasten sind die Interferenzen von Fosetyl-Al in den MRM-Übergängen von AMPA und Phosphonsäure markiert. © Waters

All diese Anforderungen an eine herausragende chromatographische Performance erfüllen die zwei Methoden, die mit dem Fokus auf Analytanzahl zum einen und Sensitivität zum anderen auf der Torus™ DEA Säule entwickelt wurden.

Bild 4. Methode A: Links sind die analysierten Verbindungen gelistet. Rechts zeigen die Chromatogramme beispielhaft ausgewählter Analyte die Elutionsreihenfolge und Peakform in einem mit 50 µg/kg dotierten Tomatenextrakt nach QuPPe. (Bild: Waters) © Waters

Grund 2: Die Analyte. Die beiden HILIC-basierten Methoden unterscheiden sich in der Zusammensetzung der wässrigen mobilen Phase. Die Zugabe von Ammoniumformiat in angesäuertes Wasser ermöglicht die Analyse von Chlorat und Perchlorat als zusätzliche Parameter in Methode A und legt den Schwerpunkt auf die Anzahl der erfassbaren Analyte. Dies bietet den entscheidenden Vorteil die Einzelanalysen einer Probe zu reduzieren und gleichzeitig zuverlässig ein MRL (Maximum Residue Limit) von 10 µg/kg auch in komplexen Matrizes zu erreichen. In Bild 4 sind die in Methode A erfassten Analyte und beispielhaft die Chromatogramme mit Peakform und Elutionsreihenfolge für einige der Verbindungen dargestellt.

Grund 3: Die Sensitivität. Bei der Untersuchung von Kinder- und Säuglingsnahrung sowie Öko-/Bio-zertifizierten Nahrungsmitteln liegen die geforderten MRLs wesentlich niedriger und stellen eine zusätzliche Herausforderung an die Applikation. Um dies zu adressieren, wird in Methode B der Fokus auf die Sensitivität gelegt. Damit entfällt die Einbindung von Chlorat und Perchlorat, für die alternativ eine eigene kurze LC-MS/MS Methode existiert.

Bild 5: Methode B: Quantifier- und Qualifierübergänge für die herausfordernden Analyte: A: Ethephon, B: AMPA, C: Fosetyl-Al und D: Glyphosat mit 1 ng/ml (1 ppb, entspricht 2 µg/kg bezogen auf die Einwaage) in einem Tomatenextrakt nach QuPPe. © Waters

Durch die Verwendung eines pufferfreien Eluenten erhöht sich die Signalstärke für einige der Analyte bis zu Faktor 10 und ist die sichere Quantifizierung von allen Verbindungen auch deutlich unter 10 µg/kg möglich. Bild 5 zeigt beispielhaft für Glyphosat, AMPA, Ethephon und Fosetyl-Al die Quantifier- und Qualifierspuren eines mit 2 µg/kg dotierten Tomaten-Extrakts.

Grund 4: Die Probenvorbereitung. In den bisherigen Versuchen zeigte sich, dass für die Mehrzahl der untersuchten Lebensmittel das klassische QuPPe-Extraktionsprotokoll zu den gewünschten Ergebnissen führt. Für komplexere Matrizes bietet sich eine Modifizierung des Protokolls an. In unserem Beispiel wurde bei der Extraktion von Weizenmehl ein zusätzlicher Ausfrierschritt nach der Zugabe von Methanol eingebaut. Extrakte von Lebensmitteln, die einen hohen Chlorophyll- oder Pigmentgehalt aufweisen, wie Tee oder Gewürze, sollten nach der Extraktion mit einem zusätzlichen Clean-up-Schritt behandelt werden. Dazu eignet sich das simple Pass-Through Protokoll mit Oasis™ MCX Kartuschen.

Grund 5: Die Detektion. Um die Kenndaten abzusichern, wurden Tests mit Matrizes unterschiedlichster Eigenschaften, wie z. B. hohe Gehalte an Wasser, Fett, Stärke oder Zucker durchgeführt. Repräsentativ werden im Folgenden die Ergebnisse der Methode B mit Tomaten- und Weizenmehlextrakten, die für einen hohen Wasser- bzw. Stärkegehalt stehen, vorgestellt.

Die Kalibrierung erfolgte mit Matrix-matched Standards, d. h. mit nach der Extraktion in verschiedenen Konzentrationen dotierten Matrixproben. Um den Kalibrierbereich anzugeben, wurde die SANTE-Vorgabe von ± 20 % Toleranz für die Abweichung der rückberechneten Standardkonzentration mittels der Geradengleichung (Residuen) berücksichtigt. Im Falle des Tomatenextrakts erfüllen alle Analyte bis auf eine Ausnahme diese Toleranz in einem Konzentrationsbereich von 2 bis 200 µg/kg mit Korrelationskoeffizienten von r2 > 0,996. Einzig für Ethephon liegt der lineare Bereich zwischen 4 und 200 µg/kg. Im Weizenmehlextrakt können alle Analyte der Methode zwischen 4 und 400 µg/kg entsprechend der SANTE-Vorgaben mit r2> 0,996 quantifiziert werden.

Mit der Methode werden exzellente Wiederfindungsraten zwischen 80 und 120 % für alle Analyte in Tomaten- als auch in Weizenmehlextrakt bei zwei Konzentrationsniveaus (10 µg/kg und 40 µg/ kg) erzielt. Ebenfalls ausgezeichnet ist die Reproduzierbarkeit. Die relative Standardabweichung von 15 technischen Replikaten der beiden genannten Konzentrationen lag bei allen Analyten unter 10 %. 

Fazit

Mit der Entwicklung der zwei Methoden zur Bestimmung polarer anionischer Pestizide auf der Torus DEA Säule unter Verwendung der Acquity UPLC und dem Xevo TQ-XS Tandem-MS ist es gelungen, für das herausfordernde analytische Problem eine einfache und zuverlässige Lösung zu finden. Dabei kann der Anwender – je nach Anforderung – den Fokus auf maximale Anzahl der Analyte unter Einbeziehung von Chlorat und Perchlorat oder auf die optimale Empfindlichkeit für die hohen Anforderungen bei Biolebensmitteln und Kindernahrung legen.

Weitere Informationen unter #AnalyticalFoodies. 

AUTOREN

Dr. Claudia Martin, Dr. Gunnar Weibchen
Waters GmbH, Eschborn, Deutschland

Euan Ross
Waters Corporation, Wilmslow, UK

Dr. Benjamin Wuyts
Waters Corporation, Zellik, Belgien

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