Aufbau der NGS-Bibliothek

Bild 1: Workflow des „ExpressPlex Library Preparation Kit” von seqWell. © seqWell

Gemäß dem Leitfaden für den Library Preparation Kit "ExpressPlex" (s. Bild 1) wurden 4 µl Index-Reagenzien von jedem Well einer Index-Reagenzien-Platte auf eine Ready-Reaction-Mix-Platte übertragen, 4 µl DNA wurden in alle Wells der Ready-Reaction-Mix-Platte gegeben. (Jedes Well der Index-Reagenzien-Platte enthält einen anderen Index-Adapter, der an die hinzugefügte DNA gebunden wird. Diese Reaktion erfolgt in den Wells der Ready-Reaction-Mix-Platte, die zu diesem Zweck eine Enzymmischung enthalten.) Die Ready-Reaction-Mix-Platte wurde zur Fragmentierung, Indexierung und Amplifikation auf einen Thermocycler platziert. Schließlich wurden 10 µl aus jedem Well in ein 2-ml-Röhrchen (Eppendorf) gepoolt. Eine Liquid-Handling-Plattform (Firefly, SPT Labtech) führt die Proben automatisch in eine einzige Spalte einer neuen Platte zusammen (Pooling). Die daraus resultierenden Bibliotheken werden vor der Aufreinigung manuell zusammengefasst.

Aufreinigung nach dem Pooling

Nach dem Pooling wurden die Bibliotheken mit der Solid Phase Reversible Immobilization (SPRI)-Technologie in einem 0,75-fachen Verhältnis von paramagnetischen Beads (MAGwise, seqWell) zu Poolvolumen aufgereinigt (meist 720 µl MAGwise zu 960 µl gepoolten Bibliotheken).

Quantifizierung der Konzentration

Die gereinigten Bibliotheken wurden mit Hilfe des QubitTM4-Fluorometers und dem "QubitTM1X dsDNA High Sensitivity (HS)" Assay Kit (beides Thermo Fisher Scientific) quantifiziert.

Elektrophorese

Bild 2: Deck-Anordnung auf der Liquid-Handling-Plattform „firefly“ von SPT Labtech für die Probenvorbereitung. © SPT Labtech

Die Verteilung der Fragmentgrößen wurde mit dem "4200 TapeStation System" und dem "High Sensitivity D5000 ScreenTape System" (beide Agilent Technologies) bestimmt. Die über die TapeStation-Software bereitgestellten Kennzahlen enthielten durchschnittliche Fragmentgrößen im clusterfähigen (sequenzierbaren) Bereich von 400 – 1 200 bp (bp = Basenpaar) und den Anteil der Gesamtmenge, die innerhalb des sequenzierbaren Bereichs liegt.

Quantifizierung der Molarität

Die Bibliotheken wurden mit 4 nM Tris-HCl (Tris-Hydrochlorid) mit pH-Wert von 8,0 verdünnt.

Abschließende Vorbereitung für die Sequenzierung

Die zu untersuchenden Teilproben (Aliquote) jeder 4-nM-Bibliothek wurden mit je gleichem Volumen gepoolt. Anschließend wurden sie entsprechend dem Leitfaden zur Denaturierung und Verdünnung mit dem "MiSeq®"-System (Illumina) für die Sequenzierung vorbereitet. Die denaturierten Bibliotheken wurden auf eine endgültige Ladekonzentration von 15 pM verdünnt und mit dem "MiSeq Reagent Micro v2" (300 Zyklen)-Kit (Illumina) sequenziert.

Probenvorbereitung mit automatisiertem Liquid Handling

Bild 3: Deck Anordnung auf der LiquidHandlingPlattform „firefly“ für das Pooling. © SPT Labtech

Bild 2 zeigt die Anordnung der Platten auf dem Deck des Liquid-Handling-Geräts, um eine NGS-Probenvorbereitung für eine einzelne 96-Well-Platte durchzuführen. Für jede Probenplatte mit zu sequenzierender DNA wird eine Index-Platte, eine Ready-Reaction-Mix-Platte sowie zwei Boxen für Pipettenspitzen benötigt. Nach der Probenvorbereitung wird die Platte mit den DNA-Proben zur Fragmentierung, Indexierung und Amplifikation auf einen Thermocycler außerhalb des Liquid-Handling-Geräts übertragen. Das Liquid-Handling-Gerät bietet ausreichend freie Deck-Positionen, um im gleichen Durchgang eine Probenvorbereitung für eine weitere 96-Well-Platte durchzuführen.

Bild 3 veranschaulicht die Anordnung der Platten für das Pooling der Proben für eine einzelne 96-Well-Platte. Nach dem Thermocycling wird die Platte mit der amplifizierten Library (Bibliothek) für das Pooling wieder auf das Deck des Liquid-Handling-Geräts platziert. Für jede Probenplatte wird eine Reihe Pipettenspitzen und eine leere Reihe einer DNA-Platte benötigt. In jedem Durchgang können bis zu vier Library-Platten gepoolt werden.

Bild 4: Gleichgewicht der Reads in Prozent je Well und Platte; Platten 1 – 3 mit pUC19Proben, die mit dem Gerät „firefly“ von SPT Labtech automatisch vorbereitet und gepoolt wurden, sowie Platte 4 mit den manuellen Kontrolldaten. Ein ideales Gleichgewicht der Reads liegt bei 100 %/96 WellPlatte oder bei 1,04 % der gesamten Reads je Well für alle 96 Wells. Mit Hilfe des LiquidHandlingSystems wurden Daten erhalten, die mit den Daten auf manuellem Wege erhaltenen Reads in hohem Maße vergleichbar sind. © seqWell

Es zeigte sich, dass die NGS-Probenvorbereitung von zwei 96-Well-Platten mit der automatischen Liquid-Handling-Plattform weniger als sechs Minuten dauert. Für das Pooling von zwei 96-Well-Platten werden weniger als zehn Minuten benötigt.

Ergebnisse

Mit dem Liquid-Handling-Automat wurden basierend auf dem beschriebenen Workflow mit drei 96-Well-Platten insgesamt 288 individuelle NGS-Bibliotheken erstellt. 96 Bibliotheken wurden manuell hergestellt. Die Anzahl der sequenzierten Reads je Well, prozentual zu allen erhaltenen Reads, zeigt die Konsistenz der Probenvorbereitung über alle Bibliotheken hinweg. Bild 4 zeigt ein sehr stabiles Gleichgewicht der Reads für die automatische und manuelle Probenvorbereitung, sowohl innerhalb der Platten als auch über die Platten hinweg. Die Variationskoeffizienten (CVs) für die einzelnen Platten sind wie folgt: Platte 1: 9,9 %, Platte 2: 9,5 %, Platte 3: 10,3 %, Platte 4: 8,8 %. (Platten 1 – 3 mit automatischer Probenvorbereitung, Platte 4 mit manueller Probenvorbereitung zum Vergleich).

Diskussion

Bild 5: Aus den Experimenten ergab sich folgender Zeitaufwand für die Methode nach dem beschriebenen Verfahren: 1 536 Proben können in zwei Kohorten in einem Zeitraum von 24 Stunden sequenziert werden. © seqWell

Mit dem verwendeten Library Preparation Kit, der eingesetzten Liquid-Handling-Plattform sowie einer ausreichenden Anzahl an Thermocyclern kann ein einzelner Labormitarbeiter 1 536 Bibliotheken generieren und diese in etwa 24 Stunden sequenzieren. Um die Instrumente und ihre Funktionen bestmöglich zu nutzen, besteht die Möglichkeit, 16 Platten mit 1 536 Proben in zwei Kohorten mit je acht Platten aufzuteilen und die Schritte wie Probenvorbereitung, Thermocycling und Pooling effizient zu staffeln. Mit dem automatisierten System kann die Bibliotheksvorbereitung beschleunigt werden, indem zwei 96-Well-Platten in einem Durchlauf für die Sequenzierung eingerichtet und bis zu vier Platten gleichzeitig gepoolt werden. Zusätzliche Programmierschritte können hier erforderlich werden.

Durch eine schnelle, reproduzierbare Sequenzierung von Bibliotheken stellen Forschende im Bereich der Synthetischen Biologie schnell fest, ob die für sie interessanten Sequenzen in den synthetischen Systemen vorhanden sind. Die hier beschriebene Anwendung ermöglicht Hochdurchsatzlaboren eine große Anzahl von Systemen effizient zu screenen, während sich ihre Labormitarbeiter auf wichtige Analyseaufgaben konzentrieren können.

AUTOREN
John Palys
seqWell, Inc., US-Beverly, MA
[email protected]
www.seqwell.com

Anita Pearson, Ian Whitmore, Huw Rees
SPT Labtech, GB-Melbourn
[email protected]
www.sptlabtech.com