Bild 2: Darstellung zum 5-fach miniaturisierten Nextera XT-Protokoll; pre-PCR in Farbe Pink und post-PCR in Türkis. © SPT Labtech

Das mit dem System "mosquito HV" um den Faktor 5 miniaturisierte Nextera-XT-Protokoll (s. Bild 2) wird bei SEQ-IT im Monat für durchschnittlich 660 Library Preparations angewendet, was auf das Jahr gerechnet circa 8 000 Probenvorbereitungen ergibt.

Tabelle 1: Informationen zu den 50 Proben des repräsentativen Sequenzierlaufs. © SEQ-IT

Die Library Preparation von 48 Proben dauert hier erfahrungsgemäß 5,5 Stunden, während die Bearbeitungszeit von 96 Proben – einschließlich der PCR-Zyklen – 6,5 Stunden in Anspruch nimmt. Für die Sequenzierung wird die MiSeq™-Plattform von Illumina eingesetzt. Ein repräsentativer Sequenzierlauf umfasst 50 Proben, die mit dem 5-fach miniaturisierten Nextera XT Protokoll vorbereitet und auf der MiSeqTM Plattform mit 500 Zyklen Sequenzierungsreagenz (v2, Illumina) in einem 2-x-250-nt-Modus sequenziert wurden. Näheres zu den 50 Proben ist in Tabelle 1 gezeigt. Die DNA-Konzentration als Input für die Tagmentierung betrug 0,2 ng/μl.

Bild 3: Darstellung der typischen Größenverteilung des Insertproben-Pools nach der Tagmentierung und dem Bead-Clean-up. © SEQ-IT

Die Größe der Library wurde mit einem Bioanalyzer nach der Tagmentierung der Amplikons und der PCR-Amplifikation der fragmentierten DNA (vor der Normalisierung) analysiert. Die Ergebnisse zeigen eine typische Größenverteilung mit einer durchschnittlichen Größe von etwa 500 bp, was auf eine gute Tagmentierungsqualität hinweist (Bild 3).

Bild 4: 84,3% der Sequenzierdaten wiesen einen QC-Wert ≥30 auf. © SEQ-IT

99,54 % der Reads wurden korrekt bestimmt und 84,3 % der Sequenzierdaten wiesen einen QC-Wert ≥ 30 auf, was bei dieser Amplikon-Methode dem zu erwartenden Bereich entspricht (Bild 4).

Bild 5: Anteil der einzelnen Proben am Gesamtoutput. Die 42-HIV-Amplikons sind türkis und die 6-HIV-Ganzgenome violett dargestellt. Probe 19 hatte eine niedrige DNA-Inputkonzentration. Die Negativkontrollen sind durch Sternchen gekennzeichnet. © SEQ-IT

Der gewünschte Output jeder Probe wurde zu Anfang berechnet, um die Genauigkeit des "mosquito HV"-Systems zu bewerten. Der Anteil der 42 HIV-Amplikone (2,5 kb) wurde so berechnet, dass er jeweils etwa 2 % entspricht, während die sechs HIV-1-Gesamtgenome einen Anteil von jeweils 1 % haben sollten (Bild 5). Der Anteil jeder einzelnen Probe am Gesamtergebnis stimmt mit dem erwarteten Prozentsatz überein, was die hohe Genauigkeit unterstreicht.

Fazit

Die Miniaturisierung der Nextera XT Library Preparation auf dem System "mosquito" hat zu erheblichen Kosteneinsparungen von bis zu 80 % geführt, ohne die Qualität der Sequenzierdaten zu beeinträchtigen. Messwerte wie Fragmentierungsgrad der Proben, Mapping-Raten, QC-Werte und die Verteilung der einzelnen Proben im Gesamtoutput zeigten sehr gute Ergebnisse auch bei einem 5-fach miniaturisiertem Volumen. Darüber hinaus kann der gesamte Workflow innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden, was einen höheren Durchsatz für größere Projekte ermöglicht, während gleichzeitig nur ein minimaler Probeneinsatz erforderlich ist.

Zusätzlich reduziert der miniaturisierte Workflow die Belastung des Personals durch manuelles Pipettieren, den damit verbundenen Zeitaufwand und bewirkt auch eine Verringerung von Kunststoffabfällen. Dies macht den automatisierten und miniaturisierten Workflow sowohl zu einer (kosten-)effizienten als auch umweltfreundlicheren Lösung. Dies könnte eine breitere Anwendung von NGS vereinfachen.

AUTOREN
Jing Zhang, Anna Chanou
SPT Labtech, UK-Melbourn
[email protected]
www.sptlabtech.com

Martin Däumer, Alexander Thielen
SEQ-IT GmbH & Co. KG, Kaiserslautern
[email protected]
www.seq-it.de