Beyond GenomicsMultiplex-Analyse von Proteinen und Phosphoproteinen

Bild 1: Übersicht des DigiWest-Analyseprinzips. Ausgangspunkt sind Zellpellets, Zelllysate oder Gewebeproben (1). Aus diesen wird im ersten Schritt eine SDS-PAGE durchgeführt, wie bei einem klassischen Western geblottet, dann aber jede Lane des Blots in 96 Größenfraktionen zerlegt (2). Alle Proteine einer Größenfraktion werden eluiert und mittels Avidin-Biotin-Bindung auf eine Population/Farbe Luminex-Beads geladen. Da Hunderte von Bead-Farben verfügbar sind, können in diesem Schritt alle 96 Größenfraktionen einer Lane auf 96 Bead-Farben gebunden und damit die Proteingrößen „codiert“ werden. Die 96 verschiedenen Bead-Populationen werden hernach vereinigt (3). Dieser Bead-Pool wird auf 96-Well-Platten verteilt und in jedem Well mit einem primären Antikörper inkubiert, was die parallele Analyse von bis zu 800 Antikörpern ermöglicht. Anschließend werden PE-markierte spezies-spezifische sekundäre Antikörper dazugegeben (4). Die semiquantitative Messung erfolgt auf einem Luminex Flexmap 3D-Gerät, und zwar dergestalt, dass die verschiedenen Größenfraktionen zusätzlich Auskunft über die Molekulargewichte der analysierten Protein geben – vergleichbar dem Western Blot, der ein sehr ähnliches Bild zeigt (5). Aus diesen Rohdaten werden die digitalen Daten extrahiert, die dem DigiWest den Namen gegeben haben. (Bild: NMITT)