Beyond Genomics

Multiplex-Analyse von Proteinen und Phosphoproteinen

Eine neue Methode des Multiplex-Protein-Profiling bietet vielschichtige Anwendungsmöglichkeiten: Sie reichen von mechanistischen Studien der Wirkweise von Arzneimittelkandidaten, über Biomarkerforschung und prädiktive Toxikologie bis hin zur personalisierten Onkologie.

DigiWest-abgeleitete Western-Blot-„Mimics“ von 106 verschiedenen Antikörpern. Es handelt sich um eine graphische Darstellung von via DigiWest-Analyse generierten digitalen Daten, die in ihrem Muster denen des herkömmlichen Western Blots sehr ähneln, aber auch die Dimension der Vervielfältigung, also der parallelen Analyse von Hunderten von Proteinen, erahnen lassen. (Bild: NMITT)

Die Publikation der ersten Version des humanen Genoms (Lander et al. Nature 2001) leitete eine innovative, produktive und für die biologischen Wissenschaften revolutionäre Phase der Genomik ein. Die Microarray-Technologie ermöglichte plötzlich Expressionsanalysen von ganzen Genomen (Shoemaker et al. Nature 2001), die RNA-Interferenz-(RNAi-)Technologie ließ gar eine funktionelle Charakterisierung von Genen im Hochdurchsatz zu (Sönnichsen et al. Nature 2005). Genomische Technologien wurden breit kommerziell verfügbar und haben seither nicht nur die Medikamentenentwicklung und unser Verständnis von Krankheiten, sondern die gesamten Lebenswissenschaften nachhaltig verändert und vorangebracht. 

Allerdings gibt es inzwischen auch Ernüchterung: Allein über genomische Informationen lassen sich viele biologische Prozesse nicht vollständig erklären; epigenetischen, metabolomischen und proteomischen Informationen kommt dabei eine zunehmende Bedeutung zu, was in den letzten Jahren zu einer Weiterentwicklung auch dieser „Omics“-Technologien geführt hat. Und: Einige neuere Studien deuten darauf hin, dass Protein-Daten oft wesentlich aussagekräftiger zu sein scheinen als genomische Daten (Zhang et al. 2017).

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Multiplex-Protein-Profiling
Proteine sind die Akteure der zellulären Signalübertragung: Sie und ihre aktiven phosphory-lierten Formen („Phosphoproteine“) lösen Signalkaskaden aus und übermitteln Signale. Dass sie damit Endpunkte für biologische Analysen sind, ist nicht neu: Der klassische Western Blot für Untersuchungen an Proteinen und Phosphoproteinen ist im Labor noch immer der lang bewährte Gold-Standard, der sich durch gute Größenauflösung und Sensitivität auszeichnet. Doch ein Western Blot analysiert lediglich ein, zwei Proteine, was Generationen von Doktoranden in mühevoller Kleinarbeit leidvoll erfahren mussten. Und auch ein ELISA, obwohl mit größerem Probendurchsatz ausgestattet, erlaubt keine komplexen Analysen. Bessere Möglichkeiten offerieren da Bead- oder Aptamer-basierte Panels (z.B. Luminex, Soma- Logic), die aber beim Nachweis von Phos- phoproteinen klare Schwächen haben. Und auch die Massenspektrometrie als eine umfassende Methode zur Analyse von tausenden Proteinen, ist, trotz immenser technologischer Fortschritte, immer noch keine gangbare Option für jede Anwendung. Besonders der Aufwand, die Kosten und die Notwendigkeit von sehr hohen Mengen an Probenmaterial für den Nachweis von Phosphoproteinen stellen immer noch Limitationen dar. 

Bild 1: Übersicht des DigiWest-Analyseprinzips. Ausgangspunkt sind Zellpellets, Zelllysate oder Gewebeproben (1). Aus diesen wird im ersten Schritt eine SDS-PAGE durchgeführt, wie bei einem klassischen Western geblottet, dann aber jede Lane des Blots in 96 Größenfraktionen zerlegt (2). Alle Proteine einer Größenfraktion werden eluiert und mittels Avidin-Biotin-Bindung auf eine Population/Farbe Luminex-Beads geladen. Da Hunderte von Bead-Farben verfügbar sind, können in diesem Schritt alle 96 Größenfraktionen einer Lane auf 96 Bead-Farben gebunden und damit die Proteingrößen „codiert“ werden. Die 96 verschiedenen Bead-Populationen werden hernach vereinigt (3). Dieser Bead-Pool wird auf 96-Well-Platten verteilt und in jedem Well mit einem primären Antikörper inkubiert, was die parallele Analyse von bis zu 800 Antikörpern ermöglicht. Anschließend werden PE-markierte spezies-spezifische sekundäre Antikörper dazugegeben (4). Die semiquantitative Messung erfolgt auf einem Luminex Flexmap 3D-Gerät, und zwar dergestalt, dass die verschiedenen Größenfraktionen zusätzlich Auskunft über die Molekulargewichte der analysierten Protein geben – vergleichbar dem Western Blot, der ein sehr ähnliches Bild zeigt (5). Aus diesen Rohdaten werden die digitalen Daten extrahiert, die dem DigiWest den Namen gegeben haben. (Bild: NMITT)

DigiWest: ein Multiplex-Western
In dieser Situation haben Markus Templin und sein Team am Naturwissenschaftlichen und Medizinischen Institut (NMI), Tübingen, eine Methode des Mulitplex-Protein-Profiling entwickelt, die auf den Qualitäten des klassischen Western Blots aufbaut. Durch eine Kombination mit der Luminex-Bead-Technologie können diese Qualitäten quasi hundertfach multipliziert werden; es können also faktisch Hunderte von Western Blots in einem Experiment durchgeführt werden - und das bei einem minimalen Gesamtprobenbedarf von nur 20-50 µg Totalprotein und einer dem Western Blot vergleichbaren Sensitivität. Wie das genau funktioniert ist in Bild 1 detailliert dargestellt. Die Methode wurde nach ihrer Entwicklung sorgfältig sowohl mit dem klassischen Western Blot als auch mit der Massenspektrometrie verglichen und die Ergebnisse wurden erfolgreich publiziert (Treindl et al., Nature Communications 2016).

Der Kern der DigiWest-Technologie basiert neben einigem Geräteaufwand und Hunderten von verschiedenfarbigen Luminex-Beads vor allem auf einem Panel von vorvalidierten Antikörpern, von denen am NMI inzwischen fast 2000 getestet wurden. Etwa 1000 Antikörper wurden positiv validiert und stehen für DigiWest-basierte Multiplex-Protein-Analysen aus humanen und murinen Zell- und Gewebe- proben zur Verfügung.

In einem weiteren Schritt wurden auch für Ratten-, Hunde-, Cynomolgus- und Minipig-Materialien entsprechende Antikörper-Panels validiert, so dass die Anwendungsmöglichkei-ten sehr breit sind: DigiWest-Studien finden in Biomarkerforschung, prädiktiver Toxikologie, In-vivo-Pharmakologie und translationaler Forschung Anwendung. Das NMI bietet seine inzwischen proprietäre DigiWest-Technologie als Dienstleistung für Pharmafirmen, Biotechnologieunternehmen und die akademische Forschung an. Extra dafür wurde eine neue Niederlassung der NMI TT Pharmaservices, der CRO-Firma des NMI, in Berlin gegründet.

Bild 2: Anwendung des DigiWest in der personalisierten Onkologie. NMI TT Pharmaservices untersucht per DigiWest die von der Firma cpo cellular phenomics & oncology generierten, patientenabgeleiteten 3D-Tumororganoide. Dabei werden von cpo aus Biopsien von Primär-tumoren sogenannte „Patient-Derived 3D“-Modelle (PD3Ds) kultiviert, die in Architektur und Funktionalität dem Primärtumor sehr nahe kommen und damit wesentlich bessere Modelle für die translationale Krebsforschung darstellen als traditionelle Zelllinien. cpo führt an diesen PD3Ds Medikamententests im 384-Well-Maßstab durch, welche mittels einer parallelen DigiWest-Analyse um mechanistische Profilierungsdaten zum Status der Signaltransduktion in den verschiedenen Tumoren ergänzt werden. (Bild: NMITT)

DigiWest in der translationalen Biomarkerforschung
Erstes Anwendungsfeld des DigiWest und Erfolgsgebiet par excellence ist die Identifika-tion von Biomarkern, also von Proteinen, die zum Beispiel einen prädiktiven Wert für die Arzneimitteltherapie haben könnten, indem sie Subpopulationen von Patienten identifizieren, für die eine bestimmte Therapie einen höheren Behandlungserfolg verspricht bzw. nicht indiziert ist. Typischerweise werden in solchen Biomarkerstudien Proben von Patienten, welche sich als sensitiv bzw. resistent gegenüber einer bestimmten Behandlung erwiesen haben, per mRNA-Expressionsanalyse untersucht, um entsprechende Markergene zu finden. DigiWest eröffnet für diese Untersuchungen nun die Möglichkeit des Profilings von Schlüsselpunkten der zellulären Signaltransduktion auf der Ebene von Proteinen und vor allem von Phosphoproteinen. 

In einer derzeit am NMI stattfindenden Studie wurden Tumorgewebe von Ovarialkarzinompatientinnen, die sich als sensitiv bzw. resistent gegenüber der Behandlung mit Cis-Platin erwiesen hatten, per DigiWest auf 478 verschiedene Total- und Phosphoproteine untersucht. Zum einen ermöglichte dies detaillierte Einblicke in mögliche Resistenzmechanismen, zum anderen wurden eine Reihe von Biomarker-Kandidaten identifiziert, von denen einige Phosphoproteine sind – was wiederum den Vorteil des DigiWest gegenüber genomischen Ansätzen verdeutlicht.

DigiWest in der personalisierten Onkologie
Genau dieser Vorteil des DigiWest wird auch in einer Zusammenarbeit des NMI mit der Firma cpo cellular phenomics & oncology genutzt: Basierend auf der von cpo zusammen mit Kollegen der Universitätsklinik Charité und des Pharmakonzerns Eli Lilly entwickelten Methode der Kultivierung von patientenabgeleiteten 3D Tumororganoiden aus Primärtumoren („PD3Ds“, Boehnke et al. J Biol Screen 2016) führt cpo mit diesen PD3Ds Testungen von Medikamenten und Kombinationstherapien durch, mit dem Ziel einer Individualisierung der Chemotherapie von Tumorerkrankungen. Neben der phänotypischen In-vitro-Testung führt cpo parallel auch per Panel Sequencing eine Charakterisierung des genetischen Hintergrundes der PD3D-Modelle durch. Und obschon diese genomischen Daten sehr häufig die in der In-vitro-Medikamententestung beobachteten phänotypischen Muster erklären, ist das nicht immer der Fall, so dass die entsprechenden PD3D-Modelle auch einem Protein Profiling durch DigiWest zugeführt werden (Bild 2). Durch die Zusammenstellung eines Panels von 122 Proteinanalyten (darunter 35 Phosphoproteine), die eine Reihe von verschiedenen relevanten Pathways abdecken, konnten sehr detaillierte Einblicke in die Biologie der individuellen Tumoren gewonnen werden. Obwohl selbst kein diagnostischer Assay im klinischen Sinne, besitzt der DigiWest damit ein hohes Potential für RUO-(research use only) basierte Untersuchungen in der personalisierten Onkologie. 

Fazit
DigiWest ist eine neue Multiplex-Immunoassay-Methode, die ein komplexes Protein-Profiling von derzeit bis zu 800 Analyten je Probe ermöglicht. Wesentliches Alleinstellungsmerkmal ist dabei auch die Zugänglichkeit von Phosphoproteinen, und zwar mit guter Sensitivität und minimalen Probenmengen, so dass DigiWest-Analysen aus Zelllysaten, Geweben, aber auch aus frischen Gewebeschnitten durchgeführt werden können. Die Anwendungsmöglichkeiten der DigiWest-Technologie sind damit sehr vielschichtig und reichen von mechanistischen Studien der Wirkweise von Arzneimittelkandidaten über Biomarkerforschung und prädiktive Toxikologie bis hin zur personalisierten Onkologie. 

Referenzen
Lander ES et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 2001 Feb 15;409(6822):860-921.
Shoemaker DD et al. Experimental annotation of the human genome using microarray technology. Nature. 2001 Feb 15;409(6822):922-7.
Sönnichsen B et al. Full-genome RNAi profiling of early embryogenesis in Caenorhabditis elegans. Nature. 2005 Mar 24;434(7032):462-9.
Zhang M et al. Evidence for the importance of post-transcriptional regulatory changes in ovarian cancer progression and the contribution of miRNAs. Sci Rep. 2017 Aug 15;7(1):8171.
Treindl F et al. A bead-based Western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nat Commun. 2016 Sep 23;7:12852
Boehnke K et al. Assay Establishment and Validation of a High-Throughput Screening Platform for Three-Dimensional Patient-Derived Colon Cancer Organoid Cultures. J Biomol Screen. 2016 Oct;21(9):931-41.

Dr. Christoph Sachse,
NMI TT Pharmaservices, Berlin,
E-Mail: sachse@nmi-tt.de.
Web: http://www.nmi-tt.de

Dr. Christian R.A. Regenbrecht,
cpo cellular phenomics & oncology GmbH, Berlin.

Dr. Markus F. Templin,
NMI an der Universität Tübingen, Reutlingen.

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