HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Überprüfung der Peakhomogenität – etwas aufwendigere Maßnahmen von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Im April haben wir uns über schnelle Möglichkeiten zur Überprüfung der Peakhomogenität nach einer erfolgten Trennung unterhalten. Dabei blieb des chromatographische System unverändert. Heute geht es um etwas aufwendigere Maßnahmen.

Die Lösung

1. Änderung des Eluenten: • Zweifelsohne ist eine pH-Wert-Änderung die effektivste Möglichkeit, die Selektivität von ionischen oder sogar von polaren Analyten zu verändern. Vorschlag: ±0,5 oder ±1 pH-Einheit bei sonst konstanten Bedingungen. Als zweite, relativ einfache Möglichkeit wäre folgende zu nennen: Belassen Sie es bei dem ursprünglichen pH-Wert, stellen jedoch jenen mit einer anderen Säure/Base ein, beispielsweise statt mit Phosphorsäure (Phosphatpuffer) nun mit Perchlorsäure (Perchlorat). Ändern Sie schließlich das Pufferion, beispielsweise statt Kalium nun Ammonium.

   • Bekannte, klassische, immer wieder erfolgreiche Maßnahme: Erhöhung des Wasseranteils im Eluenten um 5...10 %.

   • Lassen Sie den Prozentanteil der organischen Phase im Eluenten konstant (beispielsweise 50 %), ersetzen jedoch 5 oder 10 % davon gegen ein anderes organisches Lösungsmittel. Einige Beispiele: Statt 50 % H2O/50 % ACN, nun: 50 % H2O/45 % ACN/5 % THF oder statt 50 % H2O/50 % MeOH, nun: 50 % H2O/40 % MeOH/10 % Butanol usw. Oder aber Sie ersetzen einfach (bei gleicher Elutionsstärke!) Acetonitril gegen Methanol. Die Peaks werden vermutlich breiter, häufig ergibt sich jedoch eine bessere Selektivität. 

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2. Änderung der Temperatur Verfügen Sie über einen kühlbaren Säulenofen, so versuchen Sie es ,,kälter", zum Beispiel bei 15 oder sogar bei 10 oC. Die Peaks werden auch hier in jedem Fall breiter, häufig ergibt sich eine bessere Selektivität, vor allem in Fällen, in denen ionische Wechselwirkungen im Spiel sind. 

3. Änderung der Säule 1. Hardware: Verwenden Sie eine längere Säule oder kleinere Teilchen. Die damit verbundene Erhöhung der Bodenzahl führt häufig zu einer nun akzeptablen Auflösung. 2. Stationäre Phase: Die Art der stationären Phase kann erwartungsgemäß die Selektivität stark beeinflussen. Das Thema ist jedoch so umfangreich, dass es im hier zur Verfügung stehenden Rahmen nicht behandelt werden kann.

Das Fazit

Oben vorgestellte Maßnahmen können mit einem in der Regel vertretbaren Aufwand realisiert werden. Bei einer wichtigen Probe sollten jedoch aufwendigere, aber sicherlich aussagekräftigere Tools ins Kalkül gezogen werden wie zum Beispiel:

• Miniaturisierung

• Säulenschaltung in Kombination mit Optimierungsprogrammen

• LC-MS(MS), evtl. LC-NMR-Kopplung

Bezüglich letztgenannter Möglichkeit bestätigt sich immer wieder: Die Kosten in Höhe von € 1500...2000, die bei der Auftragsvergabe einer LC-MS/LC-NMR-Kopplung an einen externen/internen Dienstleister anfallen, sind bei einer wichtigen Probe – global gesehen – nicht wirklich nennenswert.

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