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HPLC-TippIn wie weit beeinflusst die Probenlösung die Auflösung?

Im Oktober haben wir uns über den Einfluss des organischen Lösungsmittels in der Probenlösung sowie deren pH-Wert auf die Peakform und somit über auf die Auflösung unterhalten. Darüber hinaus spielt das Injektionsvolumen und der Verdünnungsgrad der Probenlösung eine Rolle. Es dürfte allgemein bekannt sein, dass eine Verringerung des Injektionsvolumens zu einer Verbesserung der Trennung führt, deswegen wird hier nicht weiter darauf eingegangen. Heute möchte ich gerne den Einfluss der Konzentration der Probenlösung kurz diskutieren, es geht letzten Endes um die Frage: Was ist besser, eine konzentrierte Probenlösung in einem kleinen Injektionsvolumen oder eher ein größeres Volumen einer mehr oder weniger verdünnten Lösung zu injizieren?

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Die Lösung

HPLC-Tipp: In wie weit beeinflusst die Probenlösung die Auflösung?

Betrachten wir die Abbildung, dort wird jeweils der vordere Teil von Chromatogrammen gezeigt, die bei der Injektion von vier Lösungen erhalten werden. Im Falle einer Verdünnung der Probenlösung um Faktor 1:3 (vgl. A zu B) bzw. um Faktor 1:8 Wasser/Eluent (A zu C) wird ersichtlich, dass die Auflösung zwischen Peak 1 und 2 besser wird. Eine anschließende Erhöhung des Injektionsvolumens um Faktor 3 (vgl. C zu D) führt zu keiner nennenswerten Verschlechterung der Auflösung. Die beobachtete Verbesserung der Auflösung wird durch das Verhindern von Überladung erreicht (Injektion einer verdünnten Lösung): Durch den häufig stattfindenden dualen Mechanismus bei früh eluierenden, polaren Peaks (gleichzeitig polare und apolare Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase) ergibt sich eine langsame Kinetik und damit eine lokale Überladung der Säule, was zur Peakverbreiterung führt. Im Falle von „reinen“ hydrophoben Wechselwirkungen ist jene Gefahr kaum vorhanden, siehe de facto gleichbleibende Peakform des Peaks bei 2,85 min.

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Das Fazit

Eine Verdünnung der Probenlösung mit Eluent oder – im Falle von RP-Systemen – Wasser führt in aller Regel zu einer Verbesserung der Trennung. Es ist ratsam, ein eher größeres Volumen einer verdünnten Lösung, denn ein kleines Volumen einer konzentrierten Lösung zu injizieren, denn: Die Gefahr einer lokalen Massenüberladung in der Säule ist größer als die einer Volumenüberladung.
© by Stavros Kromidas

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