HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp im September
Zunahme der Drift beim Gradienten durch die Alterung von ACN.

Ursachen für Drift

Der Fall
Drift ist je nachdem zwischen lediglich störend und äußerst ärgerlich. Wann ist nun mit Drift zu rechnen?

Die Lösung
Nachfolgend werden die häufigsten Ursachen genannt:

Isokratische Trennungen:

  • Die Temperatur ist nicht konstant. Das Problem ist allerdings nur dann wirklich groß, wenn eine merkliche Temperaturdifferenz zwischen Eluent und Säulenraum herrscht.
  • Bei einigen Detektoren wie elektrochemischer Detektor oder Brechungsindexdetektor dauert es recht lange, bis die Basislinie stabil ist.
  • Die Säule ist (noch) nicht im Gleichgewicht. Bei komplexen Eluenten (z.B. Puffer mit Ionenpaarreagenzien) oder beim Umspülen auf einen „ganz“ anderen Eluenten kann die Gleichgewichtseinstellung recht lang dauern.
  • Langsame Elution von Verunreinigungen aus der Säule, der Vorsäule, der Fritte usw.

Gradienten-Trennungen:

Drift beim Gradienten ist zweifelsohne ein häufigeres Problem als im Falle von isokratischen Trennungen. Die Ursache ist stets eine (große) Differenz in der UV-Absorption zwischen Eluent A und B, die vom Detektor registriert wird.

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Die Drift ist in folgenden Fällen stark:

  • Man arbeitet bei einer Wellenlänge unterhalb 220…225 nm.
  • Bei MeOH/H2O bzw. Puffer eher als bei ACN/H2O bzw. Puffer.

Wir unterscheiden wie folgt:

Positive Drift:

Eluent B – z.B. ACN – absorbiert wesentlich stärker als Eluent A – z.B. H2O. Bei niedrigen Wellenlängen kann dies sehr störend sein, man könnte in diesem Fall dem Wasser etwas UV-Absorber zugeben, z.B. einen Tropfen Salpetersäure oder Aceton pro Liter Wasser; die UV-Absorption der zwei Eluenten gleicht sich an und die Drift fällt weniger stark aus.

Negative Drift – sie tritt eher selten auf:

Eluent A absorbiert stärker als Eluent B. Das ist der Fall, wenn in der wässrigen Phase z.B. „viel“ Puffer oder sonstige UV-aktive Modifier wie Amine enthalten sind und das verwendete ACN sehr sauber und frisch ist.

Wenn die positive Drift von Tag zu Tag schlimmer wird, kann es daran liegen, dass in bestimmten ACN-Chargen die Konzentration von Verunreinigungen wie Propionitril, Acrylnitril, Methacrylnitril, Acrylamid, Aceton, Ammoniak usw. zunimmt. Darüber hinaus können in ACN Polymere entstehen. Im Bild (Quelle: Dr. Michel Pfeffer, BayerScheringPharma, Berlin) wird dargestellt, wie die Steigung beim Gradienten täglich zunimmt.

Eine Milderung des Problems besteht darin, dass in die ACN-Kapillare (vor der Mischkammer beim Hochdruckgradienten bzw. vor dem Proportionierventil beim Niederdruckgradienten) eine Al2O3-Vorsäule eingebaut wird. Dort bleibt ein Teil der Verunreinigungen irreversibel festgehalten.

Bemerkung:

Organische Verunreinigungen aus dem Wasser – die eher zu Geisterpeaks, denn zu einer Erhöhung der Drift führen – wären entsprechend mit einer C18-Vorsäule (Ort des Einbaus, s. weiter oben) leicht zu enfernen.


Das Fazit
Sorgen Sie für stabile Bedingungen (z.B. Temperatur) und equilibrieren Sie im Falle von komplexen Eluenten gründlich(er). Bei Gradientenläufen ist bei Bedarf mit Hilfe von UV-Absorbern für UV-Angleich zu sorgen, bzw. jene unerwünschte UV-aktive Verunreinigungen sind online zu entfernen. Bei starker Drift von Anfang an einer Methode kann evtl. eine kleine Veränderung in der Steilheit des Gradienten oder der Wellenlänge in Betracht gezogen werden. Das Chromatogramm bzw. die Trennung ändert sich wenig, dafür ergibt sich jedoch eine ruhigere Basislinie

© by Stavros Kromidas

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