HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

„It´s summer time...“

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Liebe HPLC-Mitstreiterinnen und -Mitstreiter,

vielleicht kennen Sie ja unsere kleine Tradition: Im Sommer wollen wir uns nur leichte „Kost“ gönnen und beschäftigen uns deswegen von Juni bis August mit kurzen, „leichtbekömmlichen“ HPLC-Tipps. Heute geht´s um Temperatur – wie sollte es im Sommer anders sein? – und um Verunreinigungen.

Verunreinigungen zum Ersten:

Können Sie einen hartnäckigen Memmory-Effekt aus dem Gerät (Autosampler, Detektorzelle usw.) weder durch Spülen mit heißem Wasser noch durch Spülen mit Acetonitril/Tetrahydrofuran/Isopropanol partout nicht entfernen, bleibt wirklich nur der altbewährte Trick übrig: Passivieren mit 6N HNO3 . Details zur Durchführung, siehe entweder in den HPLC-Tipps oder auf der Homepage von NOVIA (www.novia.de, HPLC-Tipps Archiv).

Verunreinigungen

zum Zweiten:

In einem Labor hatten die Kollegen trotz gründlichstem Spülen der Anlage monatelang immer mit einem Memmory-Effekt des zu analysierenden Wirkstoffs zu tun. Mal war der Peak im Chromatogramm kleiner, mal größer, aber er war stets zugegen – trotz neuer Säule, neuem Eluenten und ... neuem Chef. Erst die sehr(!) sorgfältige Reinigung von Rührfischen, pH-Elektrode, Waagschale, Spatel usw., das Abwischen des Arbeitsplatzes mit Methanol und die Verwendung von Einmal-Handschuhen lösten das Problem. Bei Substanzen mit starker Affinität gegenüber allerlei Oberflächen sind derartige Maßnahmen leider ein „Muss“.

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Verunreinigungen zum Dritten:

Verklebte Kugelventile in der Pumpe können mit Hilfe von Methanol/Ethanol, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran, Hexan, Methylenchlorid gereinigt werden. Testen Sie eine andere Acetonitrilcharge, einen anderen Lieferanten oder (unverständlich, aber es hilft häufig) filtrieren Sie Ihr Acetonitril – auch wenn es mit „HPLC-Qualität“ ausgewiesen ist.

Temperatur zum Ersten:

Eine Temperaturdifferenz von ca. 20 °C zwischen Eluent und Säule führt manchmal zu einer leichten Drift, die zwar nicht sehr, dennoch stört. Abhilfe: Teflonband und/oder Styropor um die Kapillare anbringen – wenn jene nicht mitthermostatisiert werden kann/darf.

Temperatur zum Zweiten

Sie sind, sagen wir, bei einer Temperatur von 30...40 °C mit der Trennung nicht zufrieden. Bevor Sie jetzt großartig die Säule oder den Eluenten wechseln, probieren Sie eine andere Temperatur aus, das geht schneller und ist billiger. Aber: Machen Sie einen richtig großen „Sprung“ nach oben bzw. nach unten: Zum Beispiel auf 60 °C und/oder auch auf 15 °C (sollten Sie keinen kühlbaren Säulenofen haben, wünschen Sie sich ihn von Ihrem Chef zu Weihnachten). Je nach vorherrschendem Mechanismus kann entweder eine schnellere Kinetik (Temperaturerhöhung) oder eine größere Enthalpie-Differenz der in Frage kommenden Analyte (Temperaturernie­drigung) zu einer merklichen Verbesserung der Auflösung führen. Denken Sie in diesem Zusammenhang auch an eine eventuelle Elutionsumkehr.

Temperatur zum Dritten:

Im Falle von schwierigen Trennungen, beispielsweise Enantiomere, muss mit dem Ziel einer besseren Selektivität bei niedrigen Temperaturen gearbeitet werden. Statt nun wie üblich die Säule zu kühlen, sollte bei etwas dickeren Säulen der Eluent gekühlt werden: Die Peakform verbessert sich, denn es wird dadurch ein radialer Temperaturgradient von der Säulenwand zur Säulenmitte und damit verbunden eine Bandenverbreiterung verhindert. © by Stavros Kromidas

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