HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Kleine Tipps zur Fehlersuche und Robustheit II

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

•Wir haben uns bereits über folgenden Trick unterhalten (s. Tipp Nr. 37 in: Stavros Kromidas „HPLC-Tipps Band 2“: Im niedrigen Wellenlängen-Bereich haben wir bei einem Wasser/Acetonitril-Gradienten häufig mit einer störenden Drift zu kämpfen, weil eine große UV-Differenz zwischen Wasser und Acetonitril herrscht und genau jene wird ja vom UV-Detektor registriert. Um die UV-Absorption nun zwischen Wasser und Acetonitril auszugleichen kann man zum Beispiel 1 Tropfen HNO3 pro Liter Wasser verwenden, die Drift wird stark reduziert. Ich höre in Seminaren diesbezüglich den Einwand, dass HNO3 eventuell den pH-Wert des Eluenten verschieben könnte (bei dieser Menge glaube ich zwar nicht, aber na ja...) bzw. HNO3 könnte die Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase beeinflussen. Okay, verwenden Sie alternativ 1...2 Tropfen Aceton, es ist in diesen Mengen chromatographisch sicherlich inerter als HNO3 und erfüllt den gleichen Zweck.

•Haben Sie auf einmal Doppelpeaks? Ich würde folgende Vorgehensweise vorschlagen, um vielleicht die Ursache zu finden: Injizieren Sie erneut. Ist der Peak jetzt okay, war es eine einmalige Luftblase/einmalig eluierende Verunreinigung. Erscheint der Peak bei der erneuten Injektion weiterhin als Doppelpeak und kann eine Koelution mit einer weiteren Komponente ausgeschlossen werden (weniger injizieren, die Trennung würde in diesem Fall besser werden), liegt es aller Wahrscheinlichkeit nach an einer blockierten Fritte (Ablagerungen, Niederschlag, Algen) oder an einem Totvolumen am Säulenkopf. Abhilfe: Fritte erneuern und/oder Säule umdrehen. (Mancher HPLC-„Freak“ legt die Säule für ein Paar Minuten ins Ultraschallbad, da sie ohnehin so nicht zu gebrauchen ist). Bleibt das Problem bestehen, so handelt es sich womöglich um den seltenen Fall, dass betreffende Komponente bei diesen Bedingungen in zwei Formen vorliegt (solvatisiert/nicht solvatisiert, ionisiert/nicht ionisiert, Monomer/Dimer). In diesem Fall variieren Sie den Eluenten/den pH-Wert geringfügig, das Problem müsste so auf zu heben sein.

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•Unterschätzen Sie nicht Temperatur-Differenzen! Dass tiefgefrorene Proben oder Standardlösungen eine nicht unbeträchtliche Zeit brauchen, um die Umgebungstemperatur im Labor anzunehmen, ist sicherlich bekannt. Man denkt in diesem Zusammenhang sicherlich auch an die Temperaturabhängigkeit des Volumens (Injektionsvolumen), der UV-Absorption, der Viskosität (Ansauggeschwindigkeit beim Aufziehen in der Spritze). Dies alles kann zur Instabilität bzw. Drift in der Peakfläche führen. Man sollte aber auch an einfache(...) Sachen denken: Zum Beispiel wird einmal 1 Liter, das nächste Mal 5 Liter Eluent im Kühlschrank aufbewahrt. Es liegt auf der Hand, dass im zweiten Fall das Vorratsgefäß eine längere Zeit benötigt, um die Umgebungstemperatur anzunehmen. Ergebnis: Anderer Druck und (wichtiger!) womöglich eine unterschiedliche Temperatur-Differenz zwischen Eluent und Säule und damit Verschiebung der Retentionszeiten.© by Stavros Kromidas

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