HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Schnelle Optimierung einer bestehenden Gradientenmethode

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Ich war kürzlich in einem befreundeten Unternehmen, in dem routinemäßig viele Gradientenmethoden laufen. Nicht alle waren aus Anwendersicht als zufriedenstellend zu bezeichnen. Wir wollten nun schauen, ob eine der wichtigsten Methoden mit einem vertretbaren Aufwand verbessert werden könnte. Der Versuch war erfolgreich. Ich möchte Ihnen nachfolgend zeigen, wie wir es bewerkstelligt haben, vielleicht können Sie davon profitieren.

Die Lösung

Bild 1 stellt die Ausgangssituation dar: ,,Üblicher" Methanol/Wasser-Gradient bei 1 ml/min, das Chromatogramm dauerte ohne Spülschritt ca. 16 min. Das war uns zu lang. Wir haben den Fluss auf 2,6 ml/min erhöht (Druck ca. 345 bar), die Retentionszeit hat sich auf ca. 10 min reduziert, Bild 2. Das war uns immer noch zu lang. Anschließend haben wir den Gradienten nicht bei 10, sondern bei 40 % Methanol beginnen lassen, Bild 3. Die Zeit war jetzt okay aber die Peakform gefiel uns nicht. Das klar erkennbare Fronting war der Hinweis da- für, dass das Probenlösungsmittel wohl nicht optimal sein konnte. Tatsächlich war die Probe laut Prüfvorschrift in Tetrahydrofuran/Acetonitril zu lösen – also in ein recht starkes Lösungsmittelgemisch im Vergleich zum Eluenten. Daraufhin haben wir die Probenlösung zweimal mit Eluent A (40/60 Methanol/Wasser) verdünnt und erneut injiziert, Bild 4. Jetzt waren wir zufrieden.

Anzeige

Bild 1...4

Das Fazit

Eine bewährte Strategie bei der Optimierung sieht vereinfacht wie folgt aus: Sorge zuerst dafür, dass die Peaks in einer ,,vernünftigen" Zeit eluieren und schau als nächstes, wie Du auf die Schnelle die Peakform verbessern kannst. Erst dann denke an eine andere Säule.

Mit eben formuliertem Ziel im Auge bedeutet dies für den Gradienten:

1. Man sollte bei möglichst hohen Flüssen arbeiten – denke an das Gradientenvolumen!

2. Man sollte mit möglichst hohen Prozenten Methanol/Acetonitril anfangen und steile Gradienten verwenden.

3. Je polarer das Probenlösungsmittel ist, um so eher wird die Probe am Säulenkopf aufkonzentriert – das Ergebnis ist eine schöne Peakform. Dieser Punkt ist um so wichtiger/notwendiger, je größer das Injektionsvolumen ist.

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige

HPLC-Tipp

Sehr kleine Peaks – was kann ich tun?

Nehmen wir an, Sie müssen Komponenten in einer extrem geringen Konzentration quantifizieren – die Peaks sind einfach sehr klein. Es geht also im vorliegenden Fall vordergründlich nicht um eine gute Auflösung, es geht um eine gute Detektierbarkeit.

mehr...
Anzeige
Anzeige