HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Von 100 % wässriger zu 100 % organischer Phase – mögliche Probleme bei Gradientenläufen

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Manche AnwenderInnen arbeiten im Gradienten-Modus mit vermischten Eluenten, manche legen jeweils 100 % A (beispielsweise Puffer) und 100 % B (beispielsweise ACN) vor und lassen das Gerät die gewünschte Mischung herstellen. Mit nicht-vermischten Eluenten kann es zu Problemen kommen, welche wären das und warum?

Die Lösung

•Wenn 100 % Puffer und 100 % ACN zusammengeführt werden, besteht die Gefahr, dass in dünne Kapillaren Salze ausfallen.

•Wird ein Gradient von 100 % A auf 100 % B gefahren, herrscht nicht nur der beabsichtigte Lösungsmittelgradient, sondern gleichzeitig ein pH-Wert- und ein Salzgradient. Womöglich ergeben sich bei nicht 100%ig konstanter Phasenoberfläche Probleme mit der Reproduzierbarkeit von Retentionszeiten.

•Wenn bei einem Hochdruckgradienten eine Pumpe stets ACN fördert, kann es zu folgenden Schwierigkeiten kommen. A: Die Dichtungen in manchen Pumpen können reines organisches Lösungsmittel auf Dauer nicht gut verkraften.

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B: ACN kann polymerisieren, es kann sich mit der Zeit an bestimmten Stellen in der Pumpe (zum Beispiel Einlassventil) oder am Eingang in die Mischkammer ein Polymerbelag bilden. Mögliche Konsequenz: Andere Mischcharakteristik, d.h. eine etwas veränderte Eluentenzusammensetzung und dami Retentionszeitverschiebungen, störende Peaks oder „Buckel“ in der Basislinie durch eine teilweise Desorption der Polymerschicht, eventuell sogar Druckschwankungen. (Bemerkung: Die Polymerschicht kann mit THF entfernt werden.) Ein möglicher Ausweg wäre, beispielsweise ein Mal im Monat die Eingänge der Mischkammer A und B zu tauschen.

•100 % Wasser oder gar Puffer stellt logischerweise eine polare Lösung dar. Es besteht bei hydrophoben RP-Phaseen die Gefahr, dass ihre Oberfläche bei 100 % A nicht benetzt wird. (Bemerkung: Es wird noch diskutiert, ob die C18/C8-Borsten tatsächlich kollabieren oder das Wasser aus den Poren abgewiesen wird oder durch die Oberflächenspannung die freie Enthalpie bei der Wechselwirkung zwischen Analyt und Phase sich ändert oder...) Fakt ist, dass die Konstanz der Retentionszeit und die Peaks, die bei über 95 % Wasser/Puffer eluieren – bei stark hydrophoben Phasen sogar bei 90 % Wasser/Puffer –, häufig zu wünschen übrig lässt. Bei später eluierenden Peaks dagegen, die bei 10 % und mehr ACN/MeOH eluieren, ergeben sich keine Probleme. In solchen Fällen sollte man den Gradienten mit einen wenig mehr organischem Anteil beginnen lassen oder auf eine etwas polarere RP-Phase ausweichen.

Das Fazit

Vormischen beim Gradienten mag etwas mehr Arbeit bedeuten, aber man geht dadurch – vor allem bei Hochdruckgradienten – manchem Problem aus dem Weg.©by Stavros Kromidas

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