HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Der pH-Wert in Probenlösungen bestehend aus Methanol/Wasser

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Im Juli haben wir uns über das Driften des pH-Wertes ins Alkalische nach der Zugabe von einem organischen Lösungsmittel in einen sauer/wässrigen Eluenten unterhalten. Eine derartige Verschiebung findet natürlich auch in Probenlösungen statt. Diese Verschiebung wird allerdings nicht immer als eine der möglichen Ursachen für Peakformveränderungen sowie Reproduzierbarkeitsprobleme mit der Retentionszeit und der Peakfläche erkannt. Deswegen wollen wir diese Thematik noch einmal aufgreifen. Heute geht es um die Frage: „Mit welchen pH-Werten bzw. pH-Wert-Verschiebungen in Probenlösungen muss ich wann rechnen?“

Die Lösung

Halten wir zunächst folgendes fest: Methanol ist ein protisches Lösungsmittel, das sowohl als Protonen-Donator als auch Protonen-Akzeptor fungieren kann. Somit hat es – ­anders als das aprotische Acetonitril – eine gewisse Eigendissoziation, es können Methanolate entstehen. So zeigen 30...100%ige methanolische Lösungen einen „pH-Wert“ von ca. 9. Das ist, etwas vereinfacht formuliert, der Grund dafür, dass beispielsweise kleine, polare Basen wie Amine in Methanol selektiver im Vergleich zu Acetonitril zu trennen sind. Nun, wir haben mehrere Experimente durchgeführt, um ein Gefühl für das Ausmaß dieser pH-Wert-Verschiebung zu bekommen. Einige der Ergebnisse werden in Tabelle 1 vorgestellt.

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•Verschiebung des „pH-Wertes“ von sauren/alkalischen Probenlösungen unterschiedlichen Methanol-Anteils.

In Tabelle 1 sind die pH-Werte einer 0,1 M sauren Probenlösung (3 Säuren als Analyte) und einer 0,1 M alkalischen Lösung, die ihrerseits eine Mischung basischer Analyten darstellt. Es ist jeweils der pH-Wert in reinem Wasser (wo ja der pH-Wert definiert ist) und in Lösungen bestimmten Methanol-Anteils angegeben. Es handelt sich hier um den absolut gemessenen „pH-Wert“, auf eine Berücksichtigung des empirischen Korrekturfaktors δ wurde hier verzichtet. Der pH-Wert einer sauren Lösung driftet nach der Zugabe von Methanol ins Alkalische, der einer alkalischen Lösung ins ­Saure. In Tabelle 1 sind für eine bessere Veranschulichung auch die pH-Werte von einzelnen sauren und basischen Analyten aufgenommen.

•Verschiebung von pKs-Werten bei Anwesenheit von Methanol.

Bei Anwesenheit von Methanol verschieben sich auch die pKs-Werte. Diese Verschiebung betrifft naturgemäß sowohl die Dissoziation der Silanolgruppen (Gleichgewicht zwischen undissoziiert vorliegenden „milden“ und dissoziiert vorliegenden „aggressiven“ Silanolgruppen) als auch die der entsprechenden Analyte. In Tab. 1 sind beispielhaft die pKs-Werte von Ameisensäure in Abhängigkeit vom Methanol-Gehalt der Probenlösung/des Eluenten zu sehen. Man könnte annehmen, dass bei den Silanolgruppen eine Verschiebung in einer wesentlich geringeren Größenordnung stattfindet, da Kieselsäure eine sehr schwache Säure ist (pKs-Wert ca. 9,50).

Das Fazit

Eine Verschiebung des pH-Wertes kann nicht verhindert werden, man kann nur versuchen, dieses Problem durch bestimmte Maßnahmen abzuschwächen bzw. dafür sorgen, dass die Verschiebung konstant bleibt, was zu reproduzierbaren Ergebnissen führen würde:

•Bei Gradienten Verwendung von vorgemischten Eluenten.

•Wenn möglich nicht in der Nähe des pKs-Wertes der kritischen Komponente arbeiten.

•Ist letzteres wegen der guten Selektivität in diesem Bereich nicht zu vermeiden, mindestens 20 mM Puffer verwenden.

•Probenlösungsmittel bzw. deren pH-Wert bewusst wählen und den Einfluss auf Peakform etc. überprüfen.

Bemerkung: Auf die hier besprochene Thematik wird in [1] ausführlich eingegangen.

[1] Stavros Kromidas (Hrsg.) „HPLC richtig optimiert“, WILEY-VCH, Weinheim, ISBN 3-527-31470-9, 2006.©by Stavros Kromidas

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