HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Legale Tricks, um eine geforderte Bodenzahl doch noch zu erreichen

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Nehmen wir an, dass eine der Forderungen in der PV einer Routine-Methode lautet: „Bodenzahl für Peak X mindestens 5000“. Dass ich der Meinung bin, eine derartige Forderung ist unnötig, bringt nichts zur Sache, lassen Sie mich dennoch diese These kurz erläutern: Bei einer Trenntechnik wie der HPLC geht es ja um Trennung und das wichtigste – um nicht zu sagen das ausschließliche – Kriterium für eine ausreichende Trennung ist die Auflösung (Auflösung, vereinfacht: Abstand zwischen den Peaks an der Peakbasis). Wenn ich nun die geforderte Auflösung von beispielsweise 1,3 oder 1,5 erreiche, bedeutet dies, dass ich in diesem Fall problemlos integrieren kann. Und es ist wirklich völlig unwichtig, ob die Bodenzahl nun 5000 oder zum Beispiel eben 4930 ist. Aber sei es drum, es ist leider keine Seltenheit, dass unsinnige Anforderungen zu unnötigen Wiederholmessungen und letzten Endes zu unnötigen Kosten führen, ohne dass die Qualität des Produktes besser wird...

Sie erreichen – um wieder zur unserer Ausgangssituation zurückzukommen - aktuell diese Bodenzahl nicht. Welche legale Tricks (merke: legal ist alles, was nicht explizit verboten ist) könnte man nun anwenden?

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Die Lösung

Vor diesem Problem standen die Kollegen in einem Labor eines Pharmaunternehmens. Es ist interessant zu sehen, was für einen pfiffigen Ausweg sie sich ausgedacht haben: Bild 1, oben, zeigt eine Trennung, bei der der Hauptpeak eine Bodenzahl von 3402 aufweist – also nicht ausreichend.

Möglichkeit 1

Man verringere das Injektionsvolumen, im vorliegenden Fall Halbierung von 20 µl auf 10 µl, Bild 1, Mitte. Die Peaksymmetrie und somit sowohl die Bodenzahl als auch die Auflösung nehmen zu. Bemerkung nebenbei: Wir alle überladen die Säule viel häufiger als wir denken. Die Bodenzahl nimmt hier zwar erfreulicherweise von 3402 auf 4364 zu, die geforderte Zahl von 5000 wird jedoch nicht erreicht, man müsste etwas anderes überlegen.

Bild 1

Möglichkeit 2

Man tauscht die Verbindungskapillare vom Probengeber zur Säule gegen eine längere aus. Dadurch, dass die Kapillare nun länger ist, kann sie jetzt in den Säulenofen hinein gesteckt werden und der Eluent wird somit vorthermostatisiert. Die erhöhte Temperatur des Eluenten in der Kapillare führt zu einer geringeren Viskosität, dadurch zu einer schnelleren Kinetik, Verbesserung der Peakform und Erhöhung der Bodenzahl auf 5145, siehe Bild 1, unten. Die Forderung „Bodenzahl gleich oder größer 5000“ wird erfüllt.

Bemerkung

Durch die längere Kapillare ergibt sich natürlich ein größeres Totvolumen, das sich vor allem bei frühen Peaks bemerkbar macht: Merke die Verschlechterung der Abtrennung des Aufsetzers vom Totzeitpeak bei der längeren Kapillare im Vergleich zu der Kürzeren (Bild 1 oberes vs. unteres Bild). Im vorliegenden Fall stört dies nicht, weil eben eine andere Forderung im Vordergrund steht. Im Falle von schnellen Peaks und/oder anspruchsvollen Trennungen (frühe, viele Peaks pro Zeiteinheit) sollte das Totvolumen der Apparatur keines Falls vernachlässigt werden. So könnte man beispielsweise hier bei Bedarf zwar eine längere, aber gleichzeitige dünnere Kapillare verwenden.

Das Fazit

Sollte eine Forderung in einem stark reglementierten Umfeld (also keine Änderung von Methodenparametern erlaubt) nicht erfüllt werden können, so gibt es für Fälle wie dem hier Besprochenen folgende Möglichkeiten, die Peakform doch noch zu verbessern: Verringerung des Totvolumens, Verringerung des Injektionsvolumens, Probenlösung mit Eluent/Wasser verdünnen und dieses erhöhte Probenvolumen injizieren.

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