HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Schnelle Überprüfung der erzielten Auflösung

Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Sie befinden sich am Ende einer Methodenentwicklung: Die Peaks machen einen ,,ordentlichen", symmetrischen Eindruck, auch die Auflösung zwischen den Peaks ist zufriedenstellend. Wie können Sie nun mit einem vertretbaren Aufwand überprüfen, ob alle vorhandenen Komponenten tatsächlich sichtbar sind?

Die Lösung

Es gibt zweifelsohne eine Reihe möglicher Wege: Von einer Änderung der chromatographischen Parameter (zum Beispiel pH-Wert, Temperatur, stationäre Phase) bis hin zu Kopplungstechniken wie LC-MS. Je nach Umfeld, Wichtigkeit der Probe etc. mag die eine oder andere Maßnahme richtig bzw. gerechtfertigt sein.

Nachfolgend ein Vorschlag, der sich relativ leicht realisieren lässt: Sie wiederholen die Trennung bei einer möglichst unterschiedlichen Kombination Säule – Eluent – Wellenlänge. Je unterschiedlicher diese Parameter in beiden Experimenten sind (orthogonale Bedingungen), um so treffsicher ist die anschließende Aussage.

Beispiel: Sie haben die Trennung mit einem sauren Acetonitril/Phosphatpuffer an einer hydrophoben, endcappten RP-Phase bei 230 nm durchgeführt. Arbeitet nun vielleicht jemand im Labor mit einer polaren RP-Phase und einem Methanol/Wasser-Eluenten bei 260 nm? Ziehen Sie jetzt Ihr schönstes Lächeln an und fragen einfach Ihre(n) Kollegen(in), ob Sie mal zwischendurch an ihrer/seiner Anlage einspritzen dürften. Die Wahrscheinlichkeit nämlich, dass 2 oder mehrere Komponenten bei unterschiedlichen chromatographischen Bedingungen und unterschiedlichen Wellenlängen sich gleich verhalten, also das gleiche Chromatogramm liefern, ist relativ gering. Ein einfaches Beispiel mit nur 2 Variablen (Säule, Wellenlänge) zeigt das Bild.

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Bei diesem ,,Spiel" sind beliebige Variablen denkbar: D Detektor, D Probelösungsmittel, D pH-Wert usw.

Das Fazit

2 Trennungen bei unterschiedlichen Bedingungen – möglichst orthogonal – sind eine gute Möglichkeit, bei vertretbarem Aufwand die Peakhomogenität zu überprüfen. 

Ó by Stavros Kromidas
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