HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Wie lange sollte die übliche Equilibrierzeit bei einer RP-Säule sein?

von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Eine RP-Säule ist häufig zu equilibrieren: Beim „Einfahren“, wenn sie neu ist, beim Umspülen, wenn ein neuer Eluent eingesetzt wird, nach einem Gradientenlauf vor der nächsten Injektion, wenn sie nach getaner Arbeit gelagert wird usw. Wie lange sollte dieser Vorgang nun dauern?

Die Lösung

Halten wir zunächst folgendes fest: Die Frage sollte weniger lauten „wie lange?“, sondern viel mehr „wie viel Volumen sollte ich über die Säule schicken?“ Beim Einfahren, Um- bzw. Spülen gilt als Faustregel: Ca. 10...15 Säulenvolumina pro Spülschritt bei einfachen Eluenten bzw. üblichen Verunreinigungen und 30...50 Säulenvolumina pro Spülschritt im Falle von komplexeren Eluenten bzw. „hartnäckigen“ Verunreinigungen.

Beispiele:

Zum Umspülen von Wasser oder Methanol auf Methanol/Wasser oder zum Einfahren einer neuen Säule reichen in der Regel 10...15 Säulenvolumina aus. Das Equlibrieren einer Säule mit einem Ionenpaarreagenzien-haltigen Eluenten oder das Regenerieren einer Säule bei einer Proben-Matrix wie Plasma oder Creme dagegen bedarf schon mindestens 30...50 Säulenvolumina.

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Bemerkung:

Das Säulenvolumen kann in erster Näherung mit folgender empirischen Formel berechnet werden:

Vs = tM x F/0,8 mit:

Vs: Säulenvolumen in ml

tM: Totzeit in min

F: Fluss in ml/min

Für eine 125 × 4-mm-Säule (Säulenvolumen von ca. 1,25 ml) beispielsweise würden im ersten Fall ca. 15...20 ml, im zweiten Fall ca. 40...60 ml ausreichen.

Für die Equlibrierzeit nach einem Gradientenlauf gibt es 2 Faustregeln:

1. 10 Säulenvolumina oder

2. entsprechend folgender empirischen Formel:

tEq = 0,15 × tM × %B mit:

tEq: Empfohlene Equilibrierzeit in min

tM : Totzeit in min

%B: Differenz Lösungsmittel (Anfang – Ende des Gradienten)

Zahlenbeispiel:

Bei einer 125 × 4-mm-Säule, einem Fluss von 1 ml/min und einem Gradienten von 30 % Acetonitril auf 80 % Acetonitril ergäbe sich als Equlibrierzeit:

tEq = 0,15 × 1 min × 50 = 7,5 min

Bei einfachen Eluenten ohne Pufferzusätze kann die Equlibrierzeit kürzer sein.

Bemerkung:

Man sollte versuchen, die Spülzeiten zu reduzieren, denn es geht ja um ein bestimmtes, notwendiges Volumen. So sollte man beispielsweise statt bei 1 ml/min 30 min lang lieber bei 2 ml/min 15 min lang spülen. Der Effekt ist – bis auf sehr wenige Ausnahmen – der gleiche, nur dass die „Spülerei“ halb so lange dauert! Wenn schon – meist unnötigerweise – bei der Trennung selbst ein Fluss von 1,5 oder 2 ml/min nicht verwendet werden darf, dann wenigstens beim Spülen.

Das Fazit

Lange/viel Spülen oder Einfahren ist nicht falsch, nur häufig unnötig.© by Stavros Kromidas

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