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HPLC-TippÜberprüfung der Säulenstabilität in der RP-HPLC

Der Fall:
In der Routine werden AnwenderInnen immer wieder mit folgender Situation konfrontiert: Die Lebensdauer manch einer Säule lässt zu wünschen übrig. Und dies, obwohl die Methode validiert und die Robustheit überprüft worden ist. Der Grund liegt oft darin, dass bei der Überprüfung der Robustheit einer Methode zwar Methodenparameter wie pH-Wert, Eluentenzusammensetzung, Säulencharge, Temperatur etc. im Focus stehen, die Säulenstabilität jedoch nicht als prüfenswert erachtet wird. Das Ergebnis: Manch´ wunderbar selektive Säule erweist sich ob ihrer geringen Lebensdauer für einen Routineeinsatz einfach als ungeeignet. Wie kann nun die Säulenstabilität geprüft werden?

Die Lösung
Man bedient sich eines 3-Stufen-Plans:

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1. Die Probe wird wie gewohnt bei den üblichen chromatographischen Bedingungen injiziert, es entsteht ein Chromatogramm.

2. Es folgt jetzt ein Säulen-Stresstest unter Anwendung der „10/30%-Regel“. D.h. die Säule wird bei etwas „aggressiveren“ Bedingungen bewusst gestresst.

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Erläuterung: Die Säule wird übers Wochenende bei Bedingungen resp. Parametern gefahren, die je nachdem ca. 10…30 % höher oder niedriger liegen als bei der Methode eingesetzten. Und zwar in diese Richtung, die für die Lebensdauer der Säule problematisch sein könnte. Beispiele: Statt einem pH-Wert von 2,5 wird nun ein pH-Wert von ca. 2 eingestellt (im Falle eines alkalischen Eluenten statt beispielsweise dem in der Methode vorgesehenen pH-Wert von 9 wird jetzt ein pH-Wert von 10 eingestellt), statt Start mit 85 % 20 mM Phosphatpuffer beim Eluenten A beginnt man mit einem Gradienten 95 % 30 mM Phosphatpuffer, statt 45 °C nun 55 °C usw. Nachfolgend sind Beispiele von zu ändernden Parametern sowie die entsprechende Variation aufgeführt.

Beispiele für „aggressive“ Bedingungen („10/30%-Regel“):

  • Höherer Wasseranteil im Eluenten (z.B. 95…100 %).
  • Niedrigerer/höherer pH-Wert (z.B. pH = 1,5 oder 9,5).
  • Höherer Salzgehalt im Eluenten (z.B. 30…50 (100?) mM).
  • Erhöhter Fluss (z.B. 2,5…3,0 ml/min).
  • Höhere Temperatur (z.B. 60…80 °C).

Es liegt auf der Hand, dass hier über das Ausmaß der Veränderung nur individuell entschieden werden kann und zudem stark methodenabhängig ist.

3. Am Montag früh wird die Trennung bei den üblichen Bedingungen durchgeführt und Retentionszeit, Peakfläche und Peakform (für eine halbquantitative Betrachtung: Bodenzahl, Tailingfaktor) mit den Freitagswerten vor der Stressbehandlung verglichen.

Durch das beschriebene Procedere wird eine Alterung der Säule von ca. 6 Monaten simuliert. Ich höre in Seminaren oft folgenden Einwand: „Warum soll ich in Gottes Namen meine teure Säule derart stressen, dass sie dabei eventuell kaputt geht?“ Meine persönliche Meinung dazu: Ich finde es sinnvoll, im Fall des Falles bereits am Montag früh erfahren zu müssen, dass die mühsam ausgesuchte Säule zwar eine gute Selektivität zeigt, dass sie allerdings für den Routineeinsatz ungeeignet ist, als dass ich dies erst nach 6 oder 12 Monaten feststellen muss. Dann ist es nämlich nach bereits abgeschlossener Validierung/Einreichung oder nach erfolgtem Methodentransfer oft zu spät, um noch etwas zu ändern. Für die KollegInnen in der Pharma: Es ist wohl die Realität, dass in Phase II oft kaum Zeit da ist, um sich noch mit nicht als akut eingestuften Sachen zu beschäftigen und in der Phase III kann man es sowieso „vergessen“...

Das Fazit
Man sollte sich vielleicht überlegen, ob für eine für die Routine vorgesehene Methode die Überprüfung der Säulenstabilität nicht als ein Bestandteil der Robustheits-Überprüfung aufgenommen werden sollte. Dazu habe ich mir nach gemachten Erfahrungen eine klare Meinung gebildet: Aus Gründen der Ökonomie wäre dies für mich unabdingbar! Der dafür notwendige Aufwand wäre vertretbar und in diesem Fall stellt er eine goldrichtige Investition dar. Vielleicht zeigt sich, dass manche Alternativsäule mit vergleichbarer Selektivität eine wesentlich bessere Stabilität aufweist. Ärger, Wiederholmessungen, unnötiger Säulenverschleiß usw. können unter Umständen im späteren Routinebetrieb so vermieden werden.

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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