Die "Kleinen" im Sommer

Wir haben an dieser Stelle uns des Öfteren über die Injektion unterhalten, aber: Diese Story ist eine unendliche… Heute möchte ich auf Probleme mit der Reproduzierbarkeit eingehen und auf einige Sachen hinweisen, die man im Alltag vielleicht bedenken sollte.

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HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp im August

Der „liebe“ Autosampler…

Wir haben an dieser Stelle uns des Öfteren über die Injektion unterhalten, aber: Diese Story ist eine unendliche… Heute möchte ich auf Probleme mit der Reproduzierbarkeit eingehen und auf einige Sachen hinweisen, die man im Alltag vielleicht bedenken sollte.

1. Temperatur:

Eine häufige Praxis ist folgende: Am Anfang einer Serie injiziert man 6 mal einer Standardlösung aus einem Vial. Wenn die Serie lange dauert, injiziert man womöglich zum Schluss als Bestätigung erneut 6 mal. Oder aber man stellt ein Vial mit der Standardlösung auf Position 1 ins Rack und die gleiche Standardösung wird zum Schluss aus dem letzten Vial im Rack injiziert. Es sind nun mehrere unangenehme Fälle denkbar: Die Temperatur der Lösung im Vial Nr. 1 ist zu Beginn vielleicht anders als die der gleichen Lösung, die zum Schluss injiziert wird, wenn beispielsweise die Proben sich längere Zeit im gekühlten Rack des Autosamplers befanden. Oder aber es herrscht eine kleine, aber merkliche Temperaturdifferenz im Rack, oder aber die Proben von außerhalb haben eine andere Temperatur, oder… Wie auch immer, können Temperaturdifferenzen bei konzentrationsempfindlichen Detektoren zu Differenzen in der Peakfläche führen: Entmischung im Vial, Temperatur- und damit Dichtegradient im Selbigen, Verdampfen von Probenlösungsmittel oder umgekehrt Kondensation auf der Unterseite des Septums.

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2. Vakuum:

Im Falle von dicht verschlossenen Vials kann bei der Injektion ein Vakuum entstehen, die Folge könnte eine kleinere als die erwartete/richtige Peakfläche sein. Folgender Fall wird nun immer wieder beobachtet: Erste Injektion „daneben“, ab der zweiten Injektion gute Reproduzierbarkeit. Mögliche Ursache: Nach der ersten Injektion gelangt durch das nun im Septum entstandene Loch etwas Luft in das Vial, Druckausgleich ist jetzt möglich, Reproduzierbarkeit ist gegeben.

3. Ansauggeschwindigkeit:

Wenn viskose Lösungen chromatographiert werden sollten (merke: (gepuffertes) Wasser ist recht viskos!) sind u.U. sehr kleine Ansauggeschwindigkeiten zu wählen. Nehmen Sie im Falle des Falles den kleinst möglichen Wert (z.B. 10 µl/min), es kann gut sein, dass der Vk Ihrer Peakfläche kleiner wird.

4. Memory-Effekt:

Sollte das Problem beim Autosampler liegen, denken Sie bitte an folgende Sachen:

  • Es könnte sein, dass dieser Analyt an der Stahl-Nadel „hängen“ bleibt, fragen Sie beim Hersteller nach alternativen Materialien für die Nadel, z.B. Messing. Dieses Problem kann sich dadurch verstärken, dass erstens Kautschuk als Septummaterial verwendet wird (ein Krümelchen bietet eine Adsorptionsfläche). Oder aber zweitens hat sich die Nadel aufgrund von zu harten Septen oder nach mehrmaligem Treffen auf die Kappen bei fehlerhaften Injektion etwas verbogen.
  • Tauschen Sie die „Sandwitch-Septen“ gegen die einfachen aus Teflon.
  • Testen Sie, ob es bei Ihrem Autosampler besser ist, vor oder nach der Injektion die Nadel mit der Purgeflüssigkeit zu spülen. Trivial, deswegen nur kurz erwähnt: Die verwendete Purgeflüssigkeit kann die Injektion beeinflussen: Peakform (z.B. Fronting bei „zu“ viel Methanol/Acetonitril), oder Memory-Effekt (z.B. mangelnde Lösekraft für apolare Bestandteile bei einer Mischung beispielsweise von 50/50 Methanol/Wasser).
  • Sollte Ihr Autosampler mit einer Spritze arbeiten, überprüfen Sie nicht nur optisch, ob dort Verunreinigungen, Abrieb, eine Luftblase usw. zu sehen sind, sondern ziehen Sie ab und zu den Stempel manuell hoch: Wenn Sie einen kleinen Widerstand spüren, ist es gut, wenn er auffallend leicht hoch und „runter“ geht, stimmt etwas nicht.
  • Memoryeffekt evtl. am Nadelsitz? Kann es sein, dass der Hersteller das Material der Dichtung geändert hat – was übrigens auch zu Geisterpeaks, erhöhten Abrieb etc. führen kann?
  • Falls in Ihrem Autosampler ein Rheodyneventil verwendet wird: Kann es sein, dass Salze aus Ihrem Puffer Risse/Kanäle in der Rotordichtung hervorgerufen haben und genau dort etwas „hängen“ bleibt, das teilweise wieder desorbiert wird und neben Problemen mit wechselnden Peakflächen auch zu Memory-Effekten führt?

Generell ist es so, dass viskose Lösungen und große Moleküle hier die größten Probleme bereiten – dennoch Kopf hoch und viel Glück!

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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