Der HPLC-Tipp im Juli

• Was heißt „0,5 %“? Vielfach versteht mancher amerikanischer Anwender folgendes: Man nehme z.B. bei der Herstellung des Eluenten 1000 ml von A und gibt 5 ml B dazu! Wenn nach X Unterredungen er jetzt tatsächlich 995 ml und 5 ml verwendet, heißt es lange nicht, dass dies in einer zukünftigen Revision der Prüfvorschrift vermerkt wird.
• Was heißt „80 %–20 % (v/v)“? „Drüben“ wird fast immer das größere Volumen vorgelegt und das kleinere (in diesem Fall die 20 %) wird dazugegeben – es wird nicht unterschieden, ob die 80 % z.B. Methanol oder Wasser sind – Volumenkontraktion lässt grüßen…
• Folgender Fall: Eine empfohlene Testlösung zur Charakterisierung von Säulen enthält unterschiedliche Substanzen und zwar in einer solchen Konzentration, dass man von allen Substanzen genügend große Peaks erhält. Zeigt nun bei der verwendeten Messwellenlänge eine Substanz, z.B. eine Base, eine schwache UV-Absorption, wird deren Konzentration einfach stark erhöht, damit dieser Peak so groß wird wie die anderen. Bei einem Tailing wird nun fälschlicherweise auf Silanolgruppen geschlossen, in Wirklichkeit ist jedoch die Säule lokal überladen (Hinweis: Dr. Stefan Lamotte, BASF).
• Exakten Formulierungen im Bereich Validierung/Qualitätssicherung wird nicht stets das gleiche Gewicht wie in Deutschland beigemessen. So ist willkürlich sowohl von „accuracy“ als auch von „acurracy of the mean“ die Rede. Eine unpräzise Formulierung jedoch wie jene (Was ist nun damit gemeint: Genauigkeit oder Richtigkeit?) oder z.B. „asymmetry“ kann zu Problemen führen: In der Regel ist trotz „asymmetry“ der Tailingfaktor gemeint (T_USP , Peakbreite bei 5 % der Peakhöhe). Wenn nun ein europäischer Kollege tatsächlich den Asymmetriefaktor ausrechnet (T_ASS , andere Formel, Peakbreite bei 10 % der Peakhöhe!) kann es, muss es aber nicht zu Problemen führen: Ein Tailingfaktor beispielsweise von 1,1 entspricht einem Asymmetriefaktor von 1,2. Bei einer akzeptierten Differenz von z.B. 5 % wäre hier alles okay. Im Falle eines stärker tailenden Peaks entspricht beispielsweise einem Tailingfaktor von 1,4 ein Asymmetriefaktor von 1,8 – eine Differenz von über 20 %! D.h., ob in einem solchen Fall ein Ergebnis „In Spec“ oder „Out Of Spec“ ist, hängt – bei gleicher Anforderung (hier ∆ 5 %) – von der aktuellen Peakform ab. Und damit verbunden, ob beim Methodentransfer alles glatt läuft oder unzählige E-Mails und Telefonkonferenzen die Folge sind…
  

Der etwas lasche Umgang mit Definitionen sowie fragliche Empfehlungen machen auch vor Regelwerken nicht halt. Und da diese Regelwerke in der Zwischenzeit de facto weltweit eine Relevanz haben, sind die Konsequenzen auch überall gegenwärtig, auch hier einige Beispiele: 

• Im Kapitel 1225 der USP („Validation of Compendial Methods“) wird zur Übeprüfung der Robustheit folgendes genannt: pH-Wert, Eluentenzusammensetzung, Temperatur, Flussrate sowie „different lots or suppliers of columns“.
  

Dazu zwei Bemerkungen: 1. Unterschiedliche Chargen von Säulen sind in der Tat ein Aspekt der Robustheit – aber nicht unterschiedliche Lieferanten! Es sei denn, die unterschiedlichen Lieferanten vertreiben das identische Säulenmaterial von unterschiedlichen Chargen. Man kann diese Formulierung aber auch anders verstehen und es wird auch anders verstanden: Ich erlebe vielfach, dass im Rahmen der Überprüfung der Robustheit unterschiedliche Säulen (z.B. unterschiedliche C18-Säulen von unterschiedlichen Lieferanten) getestet werden. Das hat allerdings nicht mit Robustheit, sondern mit Selektivität zu tun! 2. Die genannten Faktoren sind in der Regel recht dürftig, will man ernsthaft die Robustheit einer HPLC-Methode überprüfen. Trotzdem würde man USP-konform arbeiten. Man kann nun verstehen, wieso in den USA generell mir Robustheit recht unbekümmert umgegangen wird, Robustheit ist dort nicht das große Thema. Im gleichen Kapitel steht bzgl. Überpüfung der Peakhomogenität: „…Peak purity tests (e.g., using diode array or mass spectrometry) may be useful…”, um zu zeigen, dass der Peak nicht mehr als eine Komponente enthält. Erstens wird durch dieses „or“ die Aussagekraft zwischen Dioden-Array und LC/MS-Kopplung gleichgesetzt, ferner suggeriert diese Formulierung ausreichende Sicherheit, wenn man es so tut. Also wird es – da ja von der USP gedeckt – in der Tat als „Beweis“ für die Peakhomogenität der DAD verwendet, eine Praxis, die sich in der Vergangenheit rasch verbreitet hat und vielerorts immer noch Usus ist. Wie gut dieser „Beweis“ ist, haben wir an dieser Stelle öfters diskutiert.

Ein letztes Beispiel: Im „IUPAC Gold Book“ steht als Definition für den Retentiosfaktor: „Retention Factor is the ratio of the adjusted retention volume (time) and the hold up volume (time)”. Da in der Klammer „Zeit“ steht, hat es sich seit den Anfängen der Flüssigchromatographie eingebürgert, dass eben nicht das Retentionsvolumen, sondern die Retentionszeit benutzt und somit sie in Prüfvorschriften, beim Methodentransfer usw. angegeben wird. Damit haben wir uns aber die Freiheit genommen, den Fluss – da wo es sinnvoll erscheint (um z.B. kürzere Läufe zu erzielen) – ohne Probleme zu ändern. Stünde nur „retention volume“, wäre es prima, denn wir hätten in diesem Fall die Freiheit, uns nur um das Retentionsvolumen zu kümmern (Volumen = Fluss x Zeit). Ich bin ein großer Freund des intelligenten Einsatzes von Wörtchen wie „z.B.“, „oder“, „vergleichbar“ etc. Aber man sieht auch, dass ein unglücklich gewähltes „or“ das Hintertürchen für unerkannte, strukturell ähnlich aufgebauter Verunreinigungen unter einem Hauptpeak offen lässt. Und eine Klammer „bestraft“ seit Generationen Anwender, die bei einfachen Trennungen den Fluss nicht erhöhen dürfen, um schnellere Trennungen zu ermöglichen. Ich will aber heute nicht schließen, ohne mit Bezug auf das letzte Beispiel auf eine recht erfreuliche Nachricht einzugehen: In einer Revision der USP (First Supplement to USP 35-NF 30, für den 1. August 2012 geplant) wird bzgl. Fluss stehen: „Adjust for length, particle size…“, also man wird frei sein. D.h. der Fluss kann entsprechend der sich ergebenden Viskosität eingestellt werden. Und sie bewegen sich doch…

© by Stavros Kromidas
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