Der HPLC-Tipp im Januar/Februar

Peaky und Chromy in Frankfurt ...die richtigen Antworten

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Liebe Leser, im Dezember-Tipp hatte ich Ihnen vom Gespräch zwischen Peaky und Chromy erzählt. Nachfolgend noch einmal das Gespräch zur Erinnerung und anschließend die richtigen Antworten.

Peaky Säure und Chromy von Kieselhausen im Gespräch

Peaky: Hör mal Chromy, du bist so groß und mächtig, und hast so'n großes Molekulargewicht und viele funktionelle Gruppen und überhaupt... Dich muss man doch entweder bei kleinen Wellenlängen messen, weil deine viele funktionellen Gruppen dort gut absorbieren, oder aber im Interface, weiß'te, da, bei der LC/MSKopplung, dich richtig kaputt machen, um dich detektieren zu können - Mensch, bist du kompliziert...

Chromy: Hör mal Peaky, du siehst deinerseits so richtig sauer aus - du heißt ja auch so - dich muss man doch mit Seife so ordentlich alkalisch einseifen, damit du einigermaßen sauber bist und neutralisiert wirst. Erst dann, sauber und beim neutralen pH-Wert, kann man dich dann wohl vernünftig an C18-Säulen trennen, denn dann erst kannst du mit denen vernünftige, starke Wechselwirkungen eingehen.

Peaky: Hör mal Chromy, sorry, nichts für ungut, aber du siehst wirklich nicht normal aus; nicht wie eben eine kleine vernünftige Säure oder von mir aus wie eine Base. Du siehst nach nix aus, ich nehme an, du kannst mit sauren oder alkalischen Eluenten nichts anfangen, du brauchst halt einen neutralen pH-Wert und an stationärer Phase - was eigentlich: eine normale hydrophobe C18 oder eine Mixed Mode?

Chromy: Ich denke, eine ordentliche C18-Phase.

Chromy: Na gut, sag mal Peaky, ist es richtig, dass man dich und deines Gleichen gut an endcappten C18-Phasen trennen kann? Dass ihr an solchen Phasen schön schmal und selektiv zu trennen seid? Denn so wie ich euch kenne, fangt ihr sonst ein Techtel-Mechtel mit den kleinen Silanolen an und na ja...

Peaky: Lass das; mein Gott, so groß, so unbeweglich wie du bist - du kommst kaum vom Fleck. Also, man braucht für solche wie dich wohl einen kleinen Fluss, damit man eine große Bodenzahl und damit eine schnelle Kinetik hinkriegt, darüber hinaus wohl so um die 80 °C und viel Methanol, damit du am Detektor halbwegs vernünftig aussiehst.

Chromy: Liebster Peaky, so polar, so sauer wie du bist, muss man dich in reines Wasser oder von mir aus in Puffer auflösen, organisches Lösungsmittel in der Probenlösung magst wohl nicht - oder?

Peaky: Nee, wässrig passt schon.

Peaky: Wir haben zwar kaum miteinander geklönt, aber die machen jetzt echt Druck Mann, die wollen uns heute hier schnell raus haben. Und die gehen davon aus, dass wir alle unwesentlich schlechter getrennt sind. Wir haben nur noch ca. eine Minute Zeit. Komm, ich erzähle dir schnell etwas und du überlegst dir in dieser einen Minute, was richtig ist. Von den möglichen Antworten kann nur eine richtig sein - Mann, fang an, schnell zu denken!

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Die Temperatur wird erniedrigt:

  • Die Trennleistung nimmt zu.
  • Der Retentionsfaktor nimmt zu.
  • Die Bodenzahl nimmt ab (richtig).
  • Die Kinetik nimmt zu.

Kommentar: Temperaturerniedrigung bedeutet Zunahme der Viskosität und damit langsame Kinetik und breite Peaks.

Der Fluss beim Gradienten nimmt zu:

  • Die Effizienz wird besser.
  • Die Wechselwirkungen ändern sich (richtig).
  • Die Lebensdauer der Säule nimmt zu.
  • Die Peakkapazität ändert sich nicht, da Fluss-unabhängig.
Kommentar: Wenn bei konstantem Gradienten der Fluss erhöht wird, wirkt nach einer bestimmten Zeit X in der Säule eine andere Eluentenzusammensetzung und damit ändern sich die Wechselwirkungen.

Polare, moderne Phasen ("Polar Embedded Group", PEG, "Mixed Mode Phases", bifunktionale Phasen, hydrophil endcappte Phasen etc.)

  • ...zeigen eine gute Selektivität plus eine gute Effizienz.
  • ...zeigen eine gute polare Selektivität, aber eine schlechte Beladbarkeit (richtig).
  • ...zeigen eine gute Effizienz und erlauben schnelle Trennungen.
  • ...zeigen eine schlechte polare Selektivität, aber eine gute Beladbarkeit.

Kommentar: Bei diesen Säulen herrschen multiple Mechanismen und in diesem Fall haben wir sehr häufig eine lokale Überladung der Säule, was zu einer schlechten Beladbarkeit führt.

Alles klar? Du, wir sind schon da, ich springe als erster raus - okay? Tschüss dann bis zum nächsten Mal, da erzähl ich dir, was richtig und was falsch ist.

Chromy: Da bin ich aber gespannt, Tschüss, ich mache etwas vorsichtig, ich will nirgendwo hängen bleiben und mich man dann suchen tut...

Die Lösung

Peaky; Falsch: Da eben große Moleküle mit vielen funktionellen Gruppen bei höheren Wellenlängen absorbieren, sollte auch dort detektiert werden. Bei niedrigen Wellenlängen wird gezwungener Weise eine "unschöne" Basislinie in Kauf genommen, wenn kleine polare, UV-schwachaktive Moleküle zu detektieren sind.

Chromy; Falsch: Saure Komponenten sollten im Sauren getrennt werden, denn dort liegen sie ja in neutraler Form vor und können mit einer RP-Säule neutrale, hydrophobe Wechselwirkungen eingehen. Die Neutralisation mit einer Base kann außerdem, je nach den aktuellen chromatographischen Bedingungen, zu einer Salzbildung und somit zu einem Niederschlag führen.

Peaky; Falsch: Für große, neutrale Moleküle wird keine pH-Wert-Einstellung des Eluenten benötigt. Darüber hinaus sind kürzere Alkylketten auf der Oberfläche des Kieselgels von Vorteil - C8 oder vielleicht noch besser C4 oder C1 -, da an C18 sich durch die starke Wechselwirkungen unnötig lange Retentionszeiten und breite Peaks ergeben.

Chromy; Falsch: Zusätzliche Wechselwirkungen mit Restsilanol-Gruppen gehen eher protonierte Basen ein. Säuren können zwar mit Restsilanolen Wasserstoffbrückenbindungen eingehen, aber das erhöht eher die Selektivität, ein chemisches Tailing ist kaum zu befürchten.

Peaky; Falsch: Wesentlich sinnvoller als ein kleiner Fluss - der zwar zu einer Erhöhung der Bodenzahl, aber zu einer sehr langen Trennzeit führt - ist eine Gradient- Elution. Darüber hinaus sind große, hydrophobe Moleküle im apolareren Acetonitril besser zu lösen und Acetonitril liefert wegen seiner geringeren Viskosität im Vergleich zu Methanol wesentlich schärfere Peaks - gerade im vorliegenden Fall wichtig.

Chromy; Falsch: Polare Analyte sind natürlich in Wasser/Puffer gut löslich, dennoch kann eine kleine Zugabe eines organischen Lösungsmittels in die Probenlösung von Vorteil sein: Dadurch kann eine irreversible Adsorption (Physisorption durch Adhäsionskräfte) und somit ein Memory-Effekt an allerlei Stahloberflächen im Gerät wie Injektionsnadel, Oberfläche einer Stahlkapillare, Fritte, etc. vermieden werden.

Peaky; Richtig: Durch Erhöhung des Flusses ist bei modernen Säulen kaum eine merkliche Verschlechterung der Trennung festzustellen und polare Moleküle verlassen naturgemäß die Säule vor Apolaren.

Chromy; Richtig: Memory-Effekte sind zwar eher am Autosampler oder an der Säulenfritte zu befürchten, aber auch am Eingang zum Detektor ist dies möglich. Und die Gefahr ist bei größeren Molekülen größer.

© by Stavros Kromidas www.kromidas.de

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