HPLC-Tipp

Die „Kleinen“ im Sommer

Liebe HPLC-Anwenderinnen, liebe HPLC-Anwender, auch in diesem Monat wollen wir uns mit mehreren kleineren Tipps beschäftigen. Betrachten wir an dieser Stelle folgende Fälle:

Einfluss eines Vorheizers auf die Peakform, Details im Text.

Peaks eluieren früher und ihre Peakbreite hat zugenommen
Mögliche Ursache: Wir gehen davon aus, dass weder die Packungsqualität noch eine Verschiebung des pH-Wertes als Ursache infrage kommt. Der Grund könnte u.a. Schmutz an der Oberfläche der stationären Phase sein. Tritt dieser Fall ein, so ist ein Teil der aktiven Zentren belegt, die Wechselwirkungen nehmen ab, die Peaks eluieren früher. Ferner führt die geringer gewordene Zahl der aktiven Zentren, die für eine Wechselwirkung mit den zu trennenden Komponenten nun zur Verfügung stehen, zu einer lokalen Überladung der Säule. Das ist die Ursache für die Peakverbreiterung.

Auf der Seite der Probe besteht diese Gefahr häufig bei polaren/ionischen Komponenten. Was die stationären Phasen betrifft, ist in folgenden Fällen das Risiko am Größten: Mehr als eine funktionelle Gruppe an der Oberfläche, (Mixed Mode Phases, Shield-Phasen, etc.) recht polare Phasen (PFP, Biphenyl, etc.) oder bei einigen Fused-Core-Materialien in Kombination mit einer "schwierigen" Matrix wie Salben, Fermentationsbrühe, Gewebe, etc.

In diesem Zusammenhang zum Schluss noch folgender Hinweis: Eine ruhige, stabile Basislinie nach einer Spülprozedur ist im Falle eines UV-Detektors keinesfalls ein sicherer Beleg dafür, dass die Säule tatsächlich sauber ist! Begründung: Nicht jede Matrix bzw. nicht alle Bestandteile der Matrix sind UV-aktiv. So habe ich in einem Fall festgestellt, dass am Ende einer Spülphase die Basislinie im Falle des UV-Detektors kerzengerade war, die Basislinie eines Corona-Detektors jedoch riesige "Gebirge" zeigte. Und diese "Gebirge" bleiben auf der Säule, wenn eine UV-Basislinie als Beweis für eine erfolgreiche Beendigung des Spülvorgangs verwendet wird.

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Geisterpeaks - aber nur ab und zu
Geisterpeaks sind ähnlich unangenehm wie (böse) Geister selbst; die Ursachen für Geisterpeaks sind unzählig, wir haben uns an dieser Stelle ein paar Mal darüber unterhalten. Am unangenehmsten sind Geisterpeaks vor allem dann, wenn sie unregelmäßig und scheinbar völlig "willkürlich" erscheinen. Nachfolgend einige mögliche Ursachen, wenn Geisterpeaks ab und an oder alle zwei, drei Wochen oder eben nur einmal in der Woche auftreten:

  • Nach dem Saugen/Saubermachen im Labor; erkundigen Sie sich, ob vielleicht gestern die Reinigungskraft im Labor war?
  • Wurden vielleicht die Lösungsmittel- oder Abfallkanister oder sonstige größere Mengen an Chemikalien um- oder aufgefüllt?
  • Hat der Koch in der Kantine vormittags etwas Leckeres gekocht und befindet sich vielleicht die Zuluft für die Klimaanlage in der Nähe der Abluft der Kantine (analog: Hat die Produktion heute mit der Herstellung eines "HPLC-fähigen" Produktes angefangen oder befindet sich eine riesige Baumaschine mit ihrem Dieselmotor in der Nähe?).
  • Werden im Labor immer wieder Hefeproben oder Aromastoffe analysiert oder werden unregelmäßig im Kühlschrank flüchtige Proben aufbewahrt?

Methanol für polare Analyten - ja, aber...
Bekanntlich zeigt Methanol bei der Trennung von polaren Analyten im Vergleich zu Acetonitril oft eine bessere Selektivität, weil in Methanol polare Wechselwirkungen (z.B. Wasserstoffbrückenbindungen) möglich sind, im aprotischen Acetonitril dagegen nicht. Man sollte dennoch auf der Hut sein, denn: Neben der Entstehung von Methanolaten, kann so manch ein Metabolit zu Methylester umgewandelt werden. Ergebnis: Die Retentionszeit ändert sich und ich bekomme bei der LC/MS-Kopplung eine "falsche" Masse.


Was 2 µl alles bewirken können...
Ein Volumen von ca. 2 µl ist an und für sich nicht viel; dennoch gibt es Fälle, in denen 1...2 µl viel bewirken können. So in der UHPLC oder überhaupt, wenn Säulen mit einem kleinen Säulenvolumen verwendet werden, und insbesondere im Falle von früh eluierenden Peaks. Nachfolgend einige Beispiele:

  • Werden Peekkapillaren verwendet und steigt ein paar Mal der Druck plötzlich bis hin zum "High Pressure Limit" an, können aufgrund des weichen Materials an den Verbindungen Totvolumina entstehen. Diese können nach einer gewissen Zeit 1...2 µl erreichen und dies macht sich durch ein Tailing bei früh eluierenden Peaks durchaus bemerkbar.
  • Wird die Säule eine Zeit lang ohne Verschluss stehen gelassen, trocknet die stationäre Phase am Säulenkopf aus. Der plötzliche Druck nach dem Einbau (vor allem bei Flüssen von 1...2 ml/min) führt zu winzigen Totvolumina am Säulenkopf. Ergebnis wie beim eben besprochenen Fall: Tailing.
  • Sind Sie mit der Trennung im vorderen Bereich des Chromatogramms unzufrieden, so ziehen Sie zu Ihrer Probenlösung einfach ca. 2 µl Wasser an, auch eine geringe Anreicherung der Substanzzone am Säulenkopf kann die Peakform und somit die Auflösung verbessern.
  • Gleiche Temperatur zwischen mobiler und stationärer Phase ist bei kleinen Säulenvolumina wichtig. Dies kann durch eine Wärmeaustauschkapillare ("Heater", "Preheater", Vorheizer) erreicht werden. Das Volumen jener Kapillare kann sehr klein sein, 1 oder 2 µl reichen aus. Das nebenstehende Bild zeigt zwei Chromatogramme; die obere Trennung erfolgte ohne, die untere mit einem Vorheizer. Das Beispiel wurde freundlicherweise von Dr. Frank Steiner, Thermo Scientific, zur Verfügung gestellt.

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
www.kromidas.de

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