HPLC-Tipp

Trennung von polaren Analyten in der RP-HPLC

Der Fall
Nehmen wir an, Ihre Peaks, die ab ca. der 3-fachen Totzeit eluieren (also ab einem Retentionsfaktor von k = 3, was genügend starke Wechselwirkungen bedeutet), werden ordentlich getrennt. Kopfzerbrechen bereiten Ihnen eher die polaren Komponenten, die direkt nach der Totzeit eluieren - ihre Trennung ist dürftig. Verständlicherweise möchten Sie ungern die gesamte Methode verändern. Was wäre nun zu tun?

Die Lösung
Für die Verbesserung der Trennung von polaren Komponenten in der RP-HPLC könnte man sich einen 3-Stufen-Plan mit zunehmendem Aufwand vorstellen:

1. Einfache Maßnahmen - Manipulation der Probenlösung:

  • Probenlösung polarer machen, um eine "On Column Concentration" herbeizuführen: mit Wasser versetzen oder Neutralsalz (KCl, NaCl) dazu geben.
  • Das organische Lösungsmittel der Probenlösung gegen ein anderes austauschen, z.B. ACN gegen MeOH oder vice versa.
  • pH-Wert der Probenlösung verändern.


2. Relativ einfach durchzuführende methodische Veränderungen:

  • Weniger injizieren und/oder Fluss erniedrigen, denn: Bei der Wechselwirkung von polaren Komponenten mit einem RP-Material herrscht oft ein Mischmechanismus vor, was häufig zu einer lokalen Überladung der Säule und folglich zu einer langsamen Kinetik führt. Ergebnis: keine optimale Peakform. Beide hier besprochenen Maßnahmen verhindern dies.
  • Eine polare Vorsäule einbauen, z.B. CN, NH2, Diol, SiO2; Die polaren Komponenten werden dort retardiert, die später eluierende, neutrale Komponente kaum.
  • Bei Gradientenmethoden mit mehr Wasser/Puffer starten bzw. zu Beginn eine isokratische Stufe einbauen (auch hier "On Column Concentration"), bei isokratischen Läufen einen höheren wässrigen Anteil vorsehen.
  • Temperatur erniedrigen.
  • Steht eine UHPLC zur Verfügung? Mithilfe eines Restriktors nach der Säule den Druck auf ≥500...600 bar erhöhen; bei beiden zuletzt genannten Maßnahmen Veränderung der Adsorptionsenthalpie bzw. der Polarisierbarkeit von polaren Molekülen und möglicherweise Änderung der Selektivität - hoffentlich eine Verbesserung.
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3. Im Vergleich mit Punkt 2 aufwendige(re) Maßnahmen:

  • Veränderung des pH-Wertes des Eluenten.
  • Kieselgelsäule + 70...90 % Phosphat-/Acetatpuffer/ACN.
  • Mixed-Mode-Phasen.
  • HILIC.

Das Fazit
Oft sind es die einfachen Dinge, die zum Erfolg führen. Man könnte auch an kombinierte Experimente denken, etwa polare Säule und niedrige Temperatur oder Probenlösung stark verdünnen, eine polare Vorsäule einbauen, usw.
Sollte HILIC erfolgreich gewesen sein und Sie diese Methode jetzt als Routinemethode etablieren möchten, so denken Sie bitte spätestens jetzt an Yoga, Wellness-Anwendungen, etc. - Sie werden sie wahrscheinlich gut brauchen können...

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
www.kromidas.de

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