HPLC-Tipp

Unterschiede zwischen isokratischen und Gradientenläufen

Der Fall
Ca. 70...80 % der RP-Trennungen in der Routine sind Gradientenläufe. Den meisten Anwendern sind die Vorteile der Gradientenelution geläufig, so z.B. Trennung von polaren und apolaren Komponenten in einem Lauf, merklich kürzere Trenndauer im Vergleich zu isokratischen Läufen, Erniedrigung der Bestimmungsgrenze und nicht zuletzt: Ein Übersichtsgradient ist ein hervorragender erster Schritt bei der Methodenentwicklung einer unbekannten Probe. Was ist nun bei Gradiententrennungen grundsätzlich "anders" im Vergleich zu isokratischen Trennungen?

Die Lösung
Isokratische und Gradiententrennungen stellen zwar nicht gänzlich andere Welten dar, aber es gibt doch einige entscheidende Unterschiede. Nachfolgend greife ich stellvertretend zwei  Unterschiede heraus. Interessierte Leser seien auf die detaillierten Ausführungen in [1] hingewiesen.

1. Apparative Totvolumina und/oder eine schlechte Packungsquälität machen sich bei isokratischen Läufen im Falle von kleinen Säulenvolumina und Teilchen (z.B. 50 mm x 2,1 mm, ≤2...3 μm) stark bemerkbar - und dies vor allem bei frühen Peaks: breite, eventuell tailende Peaks, schlechte Auflösung. Die gleiche Säule liefert im Gradientenmodus bei sonst gleichen Bedingungen auch an "uralten" Geräten mehr als brauchbare Trennungen. In Bild 1 sind Gradientenläufe an einem Gerät aus den 1980er Jahren zu sehen, als Säule wurde eine 2-cm-Säule verwendet. Und noch etwas: Die Länge der Säule ist bei isokratischen Läufen für die Trennung viel wichtiger als bei Gradientenläufen.

Kommentare zu Bild 1

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Bild 1: Über die Gradientendauer, die Säulenlänge und den Einfluss von apparativen Totvolumina im Falle von Gradientenläufen, Details siehe Text; Säule: Synergi MAX RP, 20 x 4 mm, 2 μm.
  • Auch eine kurze Säule mit 2-μm-Material liefert im Gradientenmodus trotz beträchtlichen apparativen Totvolumina "schöne" Peaks.
  • Im Gradientenmodus ist für ca. 5...8 Peaks eine Säulenlänge von 10...20 mm oft vollkommen ausreichend (Voraussetzung: Keine schwierige Matrix).
  • Die Gradientendauer ist nicht so wichtig, wie allgemein angenommen wird: Im vorliegenden Fall sind 10 min unnötig lang, eine Gradientendauer von ca. 2 min ist lang genug (wegen der vermeintlichen Drift und der Peakbreiten beim kurzen Gradienten: Beachte die Skalierung beider Achsen!).

2. Physikalische Größen wie Säulenlänge, Fluss und Totvolumina beeinflussen bei isokratischen Trennungen die Bodenzahl, damit die Peakform und folglich die Auflösung - in das Wechselwirkungsgeschehen greifen sie nicht ein. So bleibt beispielsweise bei einer Flussänderung in einem isokratischen Lauf die Selektivität gleich. Für Gradiententrennungen gilt Gleichung 1:

siehe unter Bilder - Formel 1

Mit: k*: Retentionsfaktor einer Komponente in der Mitte der Säule, tG: Gradientendauer, F: Fluss, Δ% B: Differenz Anfangs-/Endkonzentration der organischen Komponente der mobilen Phase, Vm: Totvolumen der Säule, auch Durchfluss- oder Mobilvolumen genannt; das ist das Volumen der mobilen Phase in der Säule. Dieses entspricht dem geometrischen Volumen der Säule minus dem Skelettvolumen der stationären Phase und wird manchmal als "effektives Volumen" der Säule bezeichnet; vereinfacht kann Vm dem Volumen der Säule gleichgesetzt werden, S: Konstante, jene ergibt sich aus der Struktur des Analyten und den chromatographischen Bedingungen.

Das bedeutet: Wenn beispielsweise der Fluss oder das Säulenvolumen - also auch die Säulenlänge - sich ändern, ändert sich k*. Eine Änderung dieser Faktoren kann nun bei unterschiedlichen Analyten unterschiedlich ausfallen. Ferner ist die Selektivität als der Quotient zweier Retentionsfaktoren definiert:

siehe unter Bilder - Formel 2

Da α = k*2/k*1 gilt, kann sich folglich beim Gradienten z.B. durch Flussänderung auch die Selektivität ändern!

Merke: Wenn bei Gradiententrennungen die Säulenlänge, der Fluss und das Verweilvolumen sich ändern (letzteres sehr wichtig beim Methodentransfer!), können sich nicht nur die Peakform und die Elutionreihenfolge, sondern auch die Selektivität ändern.

Das Fazit
Je kleiner das Säulenvolumen - Stichwort UHPLC, schnelle HPLC - umso eher sollte man im Falle von Gradientenläufen bei einer Änderung von "physikalischen" Parametern wie Fluss, Säulenlänge und Dwellvolumen (bei Letzteren z.B. Wechsel des Gradientenmischers/der Probenschleife/der Verbindungskapillare) auf der Hut sein und gegebenenfalls mit Folgendem rechnen: Koelution, Elutionsumkehr und Änderung der Selektivität.

[1] "Aspekte der Gradientenoptimierung" in: S. Kromidas (Hsg.), Der HPLC-Experte - Möglichkeiten und Grenzen der modernen HPLC, Wiley-VCH Verlag, 2014, ISBN 978-3-527-33306-6.

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
www.kromidas.de

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