HPLC-Tipp

Wenn schon Druck, dann so, dass es sich für Dich lohnt…

Der Fall
UHPLC-Anlagen erlauben hohe Drücke. Solche ergeben sich, wenn beispielsweise eine lange oder eine dünne Säule und/oder kleine Teilchen verwendet werden oder aber, wenn bei niedrigen Temperaturen gearbeitet wird. Mit dünnen Säulen wird eine gute Massenempfindlichkeit erzielt, eine niedrige Temperatur ist oft hilfreich bei der Trennung von Enantiomeren oder Isomeren.

Wenden wir uns zunächst dem Ziel „besser trennen“ zu. Nehmen wir an, in einem gegebenen Fall ist eine Verbesserung der Auflösung über die Selektivität kaum möglich, da unsere Probe zwei sehr ähnliche Komponenten enthält. Hier ist eine Verbesserung der Auflösung nur über eine höhere Bodenzahl zu realisieren, eine solche führt ferner auch zu einer guten Peakkapazität (Anzahl der Peaks/Zeit). Eine große Bodenzahl ergibt sich, wenn ich eine längere Säule oder alternativ kleine Teilchen verwende. Was ist nun besser? Antwort: Längere Säule – nachfolgend die Begründung.

Die Lösung
Die Säulenlänge verhält sich mit dem Druck linear, die Teilchengröße – wie übrigens auch der Säuleninnendurchmesser – quadratisch, d.h. doppelte Säulenlänge bedeutet doppelter Druck, halb so große Teilchen hingegen Vervierfachung des Drucks. In beiden Fällen ergibt sich eine um den Faktor 2 höhere Bodenzahl, und da die Auflösung R = f (√N ) ist, hätten wir hier eine Verbesserung der Auflösung R eben um den Faktor √2 also um ca. 1,4. Betrachten wir folgendes Zahlenbeispiel:

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Ausgangssituation: Eine 10 cm lange Säule, gefüllt mit 3,5-µm-Teilchen, ergibt einen Druck von 150 bar, und ich erhalte beispielsweise eine Auflösung von R = 1,1. Mein Ziel ist es, die Auflösung auf ca. R = 2 zu erhöhen, aber ich möchte dabei keinen Druck von mehr als 600 bar erzeugen (weil meine Apparatur nur diesen Druck erlaubt oder weil ich bei höheren Drücken schlechte Erfahrungen mit Leckagen gemacht habe, oder…)

Variante A: längere Säule(n)
Doppelte Säulenlänge (20 cm); Druck 300 bar, Auflösung jetzt: ca. 1,54. Nochmalige Verdoppelung der Säulenlänge, z.B. Kopplung von vier Säulen a´ 10 cm; Druck 600 bar, Auflösung jetzt: ca. 2,16.

Variante B: Säulenlänge konstant, aber kleinere Teilchen
Die Säulenlänge bleibt konstant, ich verwende jetzt 1,7-µm-Teilchen; Druck ebenfalls 600 bar, die Auflösung jedoch ca. 1,6.

Um mit der 10-cm-Säule die gewünschte Auflösung von 2,16 erreichen zu können, müsste ich 1,3-µm-Teilchen verwenden, die allerdings einen Druck von ca. 2400 bar lieferten – und das ist in absehbarer Zeit nicht realisierbar.

Variante C: längere Säule plus kleinere Teilchen
Eine Alternative sähe folgendermaßen aus – allerdings unter der Voraussetzung, dass ich über eine geeigneter UHPLC-Anlage verfüge – Ich verwende eine 20-cm-Chromatographie-Säule, gefüllt mit 1,7-µm-Teilchen. Bei gleicher Auflösung von 2,16 ergäbe sich nun ein Druck von: 150 bar x 2 - „2“ wegen der doppelten Säulenlänge – das sind 300 bar x 4 – „4“ wegen der Teilchen –, also: 1200 bar.

Und die Retentionszeiten?
Ohne eine längere Säule ist eine Auflösung von ca. 2 nicht zu erreichen. Merke somit: Den Druck, den mir eine UHPLC-Anlage ermöglicht, sollte ich besser für eine längere Säule als für kleine Teilchen verwenden – wenn es um die ultimative Bodenzahl geht und dies ist dann notwendig, wenn ich die Auflösung nicht über die Selektivität verbessern kann.

Werfen wir jedoch konsequenterweise auch einen Blick auf die sich ergebenden Retentionszeiten, die nur von der Säulenlänge, nicht aber von der Teilchengröße abhängig sind:

  • Variante A: Verlängerung der Retentionszeit um den Faktor 2 (2 x 10 cm = 20 cm), bzw. um den Faktor 4 (4 x 10 cm = 40 cm).
  • Variante B: Retentionszeit bleibt konstant.
  • Variante C: Verlängerung um den Faktor 2 (2 x 10 cm = 20 cm).

Schauen wir uns ein weiteres Zahlenbeispiel an: Eine 15-cm-Säule mit 5-µm-Teilchen liefert eine Bodenzahl von 9000, erzeugt einen Druck von 150 bar, die Retentionszeit beträgt 12 min, es ergibt sich eine Auflösung von R = 1,2. Das ist nicht ausreichend, die Auflösung sollte auf R >2 verbessert werden, eine UHPLC-Anlage ist vorhanden.

Möglichkeit 1:
Eine 15-cm-Säule gefüllt mit 2,5-µm-Teilchen liefert eine Bodenzahl von 18 000, erzeugt einen Druck von 600 bar, die Retentionszeit beträgt weiterhin 12 min, es ergibt sich eine Auflösung nun von ca. 1,68 (1,2 x 1,4).

Zwei dieser Säulen in Serie gekoppelt (2 x 15 cm = 30 cm) liefern eine Bodenzahl von 36 000 Böden, erzeugen einen Druck von 1200 bar und bei einer Retentionszeit von 24 min ergibt sich eine Auflösung von 2,35.

Möglichkeit 2:
Vier Säulen mit 5-µm-Teilchen gefüllt, in Serie gekoppelt (4 x 15 cm = 60 cm) liefern ebenfalls 36 000 Böden (4 x 9000), erzeugen einen Druck von 600 bar (4 x 150 bar), die Retentionszeit beträgt 48 min (4 x 12 min), und es ergibt sich die gleiche Auflösung von R = 2,35.

Dies bedeutet: Bei Möglichkeit 1 „bezahle“ ich 1200 bar und bekomme dafür eine Auflösung von 2,35 in 24 min. Bei Möglichkeit 2 „bezahle“ ich 600 bar und bekomme dafür die gleiche Auflösung in 48 min.

Jetzt nehmen wir an, ich hätte sehr gerne diese Auflösung, allerdings schneller, sagen wir in 12 min. Das wäre theoretisch nur mit 1,3-µm-Teilchen möglich, der Druck betrüge jedoch 2400 bar – also das geht nicht.

Handelt es sich um eine sehr anspruchsvolle Trennung, brauche ich dafür ultimative Peakkapazität, was gleichbedeutend ist mit ultimativer, sprich: möglichst hoher Bodenzahl, sagen wir 72 000 Böden, und das Gute ist ja, ich verfüge über eine UHPLC-Anlage.

Dr. Stavros Kromidas, Rosenstr. 16, 66125 Saarbrücken, Tel. 06897 9754-0, Fax: 06897 9754-15, info@kromidas.de, http://www.kromidas.de.

Diese 72 000 Böden ergäben sich z.B. durch eine Kopplung von 8 x 15-cm-Säulen (120 cm), und in diesem fiktiven Beispiel erhielte ich bei 1200 bar eine Auflösung von R = 3,29 in 96 min, also in ca. 1,5 h. Es gibt keine andere apparative Möglichkeit, bei diesem Druck diese Bodenzahl/Peakkapazität zu erzielen, d.h.: Wenn ich den Druck von 1200 bar, den mir die UHPLC ermöglicht, optimal (hier: Erzeugung maximaler Bodenzahl) nutzen will, sollte ich lange Säulen verwenden. Die damit verbundene lange Retentionszeit muss ich in Kauf nehmen. Wenn ich in die andere Richtung ginge und kleine Teilchen verwendete, und zwar so, dass sich ein Druck von ebenfalls 1200 bar ergäbe, bekäme ich eine definitiv geringere Bodenzahl.

Das Fazit
Nehmen wir an, Sie verfügen über eine UHPLC-Anlage, somit sind Trennungen bei hohen Drücken möglich. Nachfolgend einige Empfehlungen:

1. Verwenden Sie kurze Säulen und kleine Teilchen für einfache Trennungen – und freuen Sie sich über kurze Läufe.

2. Verwenden Sie große Teilchen und lange Säule(n) für maximale Bodenzahl – und akzeptieren Sie die langen Läufe.

3. Verwenden Sie MeOH als organisches Lösungsmittel für eine gute Selektivität von polaren Analyten.

4. Erniedrigen Sie die Temperatur für eine gute Selektivität von recht ähnlichen Molekülen.

5. Kombinieren Sie bei Bedarf 2. und 3. (evtl. auch 4.) und erhöhen gleichzeitig den Fluss im Falle von Gradientenläufen, um das Gradientenvolumen zu vergrößern.

6. Verwenden Sie dünne Säulen und/oder kleine Teilchen und verbessern Sie so die Massenempfindlichkeit (falls das Injektionsvolumen nicht erhöht werden kann/darf).

Ich möchte an dieser Stelle Stefan Lamotte, BASF, für viele lange Diskussionen zu diesen Fragen danken. Eine detaillierte Behandlung des Themas findet sich in „Der HPLC-Experte 2“, in Vorbereitung.

© by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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