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System pipe-based-bioreactorspipe based bioreactors

Hochparallelisierbare mikrosystemtechnische Bioreaktoren
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System pipe-based-bioreactors: pipe based bioreactors

Brian Cahill, Gunter Gastrock, Andreas Grodrian, Karen Lemke, Robert Römer, Jörg Schemberg, Stefan Wiedemeier und Josef Metze*)

  1. Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V., Fachbereich Bioprozesstechnik, Rosenhof, 37308 Heilbad Heiligenstadt, Kontakt: josef.metze@iba-heiligenstadt.de.
Im Folgenden wird eine neue, am Heiligenstädter Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V (iba), entwickelte Technologieplattform vorgestellt, die eine alternative Methode zu Mikrotiterplatten-basierten Kultivierungsverfahren darstellt. Grundlage dieser Plattform ist das Prinzip des segmentierten Flusses, wobei die Flüssigkeit des Hauptstromes nicht mit einer zweiten, der zudosierenden Flüssigkeit, mischbar ist. Ein wesentlicher Vorteil dabei ist der, dass die so erzeugten Kompartimente als separate Reaktionsräume betrachtet und genutzt werden können ohne sich gegenseitig zu beeinflussen. Nachfolgend soll an drei Beispielen die vielfältige Applikationsbreite dieser Plattform kurz dargestellt werden.
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Weltweit wird in Forschungseinrichtungen und Unternehmen intensiv nach neuen Naturstoffen gesucht. Der Bedarf an neuen mikrobiellen Wirk- und Wertstoffen für die vielfältigsten Anwendungen in Medizin, Gesundheitspflege, Ernährungswirtschaft, aber auch im technischen Bereich ist ungebrochen. Insbesondere aus Gründen wieder zunehmender gefährlicher Infektionskrankheiten erfordern diese neue Wirkstoffe. Es gibt bereits multiresistente Krankheitserreger, die mit keinem der heute verfügbaren antimikrobiellen Wirkstoffe bekämpft werden können.

Mehrere aktuelle Studien unter Einsatz modernster molekularbiologischer Methoden haben gezeigt, dass mit 0,1...1 % nur ein Bruchteil der in der Natur vorhandenen enormen Vielfalt an Mikroorganismen bisher im Labor kultiviert werden konnte. Somit ist eine enorme Zahl von Mikroorganismen-Arten, die neue und interessante Produkte bilden können, bisher nicht nutzbar [1, 2, 3, 4, 5, 6]. Die Ursache hierfür liegt in den methodischen und insbesondere statistischen Grenzen der Verfahren, die bisher zur Suche und Isolierung neuer Mikroorganismen genutzt wurden. Es werden deshalb beim Screening immer wieder die gleichen, mit besonders großer Häufigkeit vorkommenden sowie schnell und dominant wachsenden Arten gefunden.

Die im Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.V. in Heiligenstadt in der Gruppe von Dr. J. Metze entwickelte neue Technologieplattform bietet für dieses Problem eine Lösung. Das System „pipe-based-bioreactors“ [7] eröffnet neue Möglichkeiten für biotechnologische Verfahrensabläufe, die in diesem Beitrag anhand von Applikationsbeispielen belegt werden.

Konzept und Funktionen des Systems

Formal gesehen handelt es sich um eine geschützte Marke, die es in sich hat. Das pipe-based-bioreactors-System (pbb) stellt ein innovatives Bioreaktorsystem dar, welches die Verbindung wesentlicher Eigenschaften von Bioreaktoren mit Eigenschaften von HTS-Systemen gewährleistet, deren funktionelle Bestandteile wie folgt charakterisierbar sind:

  • Kompartimentierung.
  • Kultivierung.
  • Konditionierung.
  • Manipulierung.
  • Steuerung und Automatisierung.
  • Analytik.
  • Lagerung.

Kompartimente stellen allgemein betrachtet definierte Reaktionsräume dar, die im Fall der pipe-based-bioreactors durch kleine wässrige Tropfen in einem Schlauch charakterisiert werden. Die zur Erzeugung erforderlichen Ausgangsmaterialien sind:

  • Mikrochip aus Glas oder Polymer.
  • Spritzenpumpen, gefüllt mit unpolarem Medium im Kanal 1 (z.B. Tetradekan) und polarem Medium im Kanal 2 (z.B. Medium mit Bromphenolblau).
  • Speichercoil, bestehend aus PTFE-Schlauchmaterial mit einem Schlauchinnendurchmesser von z.B. 0,5 mm.

An den Hauptkanal des Mikrochips wird das Trägermedium (z.B. Tetradekan) und an dem dünneren Zuführungskanal (unten) die zu kompartimentierende, mit Bromphenolblau gefärbte wässrige Lösung (im gezeigten Beispiel in Bild 1) angeschlossen.

Beide Lösungen werden aus einer Spritze mittels einer pulsationsfreien Spritzenpumpe in festgelegten Fließgeschwindigkeiten durch die jeweiligen Kanäle gepumpt. Die Fließgeschwindigkeit des Trägermediums ist dabei 5-mal so hoch wie die der Bromphenolblaulösung. Damit wird es möglich, pro Minute bis zu 300 Kompartimente, d.h. bis zu 5/s bei einem Volumen von 65 nl (oder einem Vielfachen) in einem Schlauch von 0,5 mm Innendurchmesser zu generieren.

Die Erzeugung eines CD-ROM-großen Schlauchcoils, wie in Bild 2 dargestellt, wird damit möglich (ca. 550 Kompartimente im 3 m Schlauchcoil). Die kontinuierlich erzeugten Kompartimente (kleine Bioreaktoren!) in einem strömenden Medium, welches mit den Kompartimenten nicht mischbar ist, wird auch als segmentierter Fluss bezeichnet.

Die besonderen Herausforderungen dieser Arbeiten bestanden in der unabdingbaren Realisierung von speziellen Wachstumsbedingungen zur Anzucht und selektiven Kultivierung von Kleinstpopulationen von Mikroorganismen, ausgehend von Einzelzellen in hochgradig parallelisierbaren mikrosystemtechnischen Reaktoren.

Mit der im Ergebnis einer durchgeführten Bewertung zur vorliegenden innovativen mikrosystemtechnischen Lösung steht jetzt ein in Quantität und Qualität völlig neuartiges Verfahren zum Screening nach neuen Wirk- und Wertstoff bildenden Mikroorganismen unter Beachtung statistischer und physiologischer Gesetze und Regeln zur Verfügung.

Die entwickelte Technologieplattform ist für verschiedenste Problemstellungen im Bereich der Biotechnologie einsetzbar, nicht nur für die Suche nach neuen Mikroorganismen, sondern auch für Hochdurchsatz-Assays unter Verwendung mikrobiologischer Modellsysteme, beispielsweise zur Untersuchung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen bei der Wirkstoffprüfung oder auch in der Schadstoffanalytik.

Gegenüber dem bekannten System der Mikrotiterplatte (MTP) stellt das System pipe-based-bioreactors (pbb) einen völlig neuartigen Ansatz dar. Erstere ist aus umfangreichen Geräte- und Laborsystemen kaum noch wegzudenken. Dennoch bietet die MTP Anlass zum Nachdenken (Bild 3):

  • Wie ist die Gefahr der Kontamination zu vermeiden?
  • Wie kann die Verdunstung vermieden bzw. reduziert werden?

Für beide Fragestellungen bietet sich das vom iba entwickelte und mit umfangreichen Applikationen versehene System pipe-based-bioreactors an.

Applikationsbeispiele Isolierung von neuen Mikroorganismen für die Wirkstoffsuche

Die traditionelle und heute noch mit verschiedenen Modifikationen angewandte Methodik bei der Suche nach neuen Mikroorganismen soll hier kurz dargestellt werden, um die wesentlichen Ursachen für deren geringe Effektivität aufzeigen zu können.

Eine bestimmte Menge einer Probe (z.B. Erde), meist 1 g, wird in einem Puffer suspendiert. Vorhandene feste Begleitstoffe werden abgetrennt und der flüssige, die Mikroorganismen enthaltende Überstand in mehreren Verdünnungsstufen auf Agaroberflächen aufgetragen, so dass nach der nachfolgenden Inkubation voneinander getrennte mikrobielle Einzelkolonien wachsen können. Das vorrangige Ziel der Verdünnung ist es, überwiegend separate bzw. „nicht kontaminierte“ Kolonien (Reinkulturen) zu erhalten. Eine Verdünnung um den Faktor 106 ist häufig erforderlich, da in einer Bodenprobe etwa 106...108 koloniebildende Mikroorganismen je g Bodentrockenmasse vorhanden sind.

Um separat gewachsene und damit auch bewertbare Einzelkolonien zu erhalten, muss eine mittlere Fläche von etwa 1 cm² (Kolonie- und umgebende freie Agarfläche) pro Kolonie zur Verfügung stehen. Theoretisch müsste man also, um jeden Mikroorganismus in der Suspension als Einzelkolonie wachsen zu lassen, entsprechend der o.g. Anzahl von Mikroorganismen pro 1 g Bodenprobe 106...108 cm2 bzw. eine Fläche zwischen 100...10 000 m2 bereitstellen. Um die Zahl überlappender Kolonien zu minimieren, müsste die Fläche nochmals vergrößert werden. Diese praktisch nicht zu realisierenden Flächen stellen eine methodische Grenze dar, die bisher nicht überschritten werden konnte.

Durch ein pragmatisches Verdünnungsregime wird bei der traditionellen Vorgehensweise erreicht, dass am Ende eines Screenings einer Bodenprobe eine überschaubare Zahl von 10...20 Agarplatten mit separaten Kolonien entsteht. Verglichen mit den o.g. großen Flächen stellen diese Agarplatten einen sehr stark begrenzten Ausschnitt um den Faktor bis 2 x 105 der eigentlich notwendigen Flächen dar. Infolgedessen geht durch die Verdünnungsschritte die Mehrheit der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen verloren. Es besteht daher die Hypothese, dass die aus statistischen Gründen nicht aufgefundenen Mikroorganismen bisher als im Labor nichtwachsende oder nichtkultivierbare Mikroorganismen eingestuft werden, weil man sich der statistischen Basis für die aus pragmatischen Gründen etablierten Methodik beim Primärscreening möglicherweise nicht mehr bewusst ist.

Durch unterschiedliche Maßnahmen wie der Verwendung verschiedener Nährmedien für die Kultivierung und den Zusatz von Antibiotika zur Hemmung des Wachstums unerwünschter Mikroorganismen (z.B. Pilze, schwärmende Bakterien) wird vielfach versucht, selten auftretenden Organismen einen Wachstumsvorteil zu geben. Damit können die geschilderten statistischen Probleme aber nicht umgangen werden.

Neben den statistischen Gründen werden oftmals auch wachstumsphysiologische Gegebenheiten wie der auf Substratmangel eingestellte Stoffwechsel der im Boden lebenden Mikroorganismen beim herkömmlichen Screening nicht beachtet. All dies führt dazu, dass nur etwa 1 % der vorhandenen Mikroorganismen beim Standardscreening kultiviert werden können.

Bei herkömmlichem Screening erfolgt die nachfolgende Kultivierung häufig in viel zu nährstoffreichen Medien, verglichen mit den im Boden aktuellen Nährstoffkonzentrationen. Zur Verdünnung wird oftmals Phosphatpuffer in hohen Konzentrationen eingesetzt, der nach eigenen Erfahrungen den häufig über den Phosphatstoffwechsel bzw. Phosphatmangel regulierten Sekundärmetabolismus vollständig blockiert.

Die Evaluierung des Systems pbb erfolgte in der Gruppe von Dr. M. Roth (Leibniz-Institut für Naturstoff-Forschung und Infektionsbiologie e.V., Hans-Knöll-Institut, HKI, Jena) durch Experimente zur Isolierung seltener Sporoaktinomyceten. Dabei wurden Suspensionen von Bodenproben unter Nutzung des Systems pbb kompartimentiert. Nach Kultivierung der Mikrokulturen in den Kapillaren wurden u. a. seltene Aktinobakterien der Gattungen Micromonospora und Nonomuraea (Bild 4) isoliert.

Schnelltest für Verderbnis- und Krankheitserreger in Lebensmitteln

Für den Verbraucherschutz ist eine Überprüfung der Lebensmittel auf bakterielle Kontaminationen während ihrer Produktion, aber spätestens direkt nach ihrer Herstellung, essentiell. Mit dem hier vorgestellten pbb-Plattform-integrierten Verfahren sollte der konventionelle mehrtägige Test innerhalb eines Arbeitstages durchführbar sein. Das Prinzip des Schnelltests für Kontaminanten in Lebensmitteln basiert auf der Kombination von selektiver Voranreicherung mittels biomagnetischer Separation und selektiver fluoreszenzoptischen Detektion im segmentierten Fluss (Bild 5).

Die selektive Voranreicherung wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. T. Bley von der Technischen Universität Dresden durchgeführt. Sie benötigt keine zeitaufwendige Vermehrung der Kontaminanten, sondern separiert die Kontaminanten gezielt aus der Lebensmittelprobe. Hierfür werden Magnetpartikel mit spezifischen Antikörpern oder mittels „phage display“ ermittelten Peptiden modifiziert, so dass diese Magnetpartikel die Kontaminanten in einem Mikroorganismengemisch selektiv binden. In einem anschließend angelegten Magnetfeld werden die an die Magnetpartikel spezifisch gebundenen Kontaminanten festgehalten, während alle anderen Mikroorganismen der Lebensmittelprobe das Magnetfeld frei passieren können. Für die Quantifizierung werden die separierten Kontaminanten zusätzlich fluoreszenzmarkiert (verschiedene Methoden sind möglich, hier beispielsweise mittels fluoreszierender Mikrokapseln). Die Suspension der fluoreszenzmarkierten Kontaminanten wird anschließend in Tropfen kompartimentiert, so dass maximal eine Kontaminante pro Kompartiment vorliegt. Somit ermöglicht die pbb-Plattform einzelne fluoreszenzmarkierte Kontaminanten sowohl mikroskopisch als auch spektroskopisch zu erfassen [8, 9]. Da in jedem Kompartiment entweder eine oder keine Kontaminante enthalten ist, und dies direkt mit einem oder keinem Fluoreszenzsignal korreliert, ist die quantitative Erfassung der Kontaminantenzahl in der ursprünglichen Lebensmittelprobe schnell detektierbar.

Die Kompartimentierung von Komplexen aus fluoreszierenden Mikrokapseln oder Magnetpartikeln mit einem Verderbniserreger zeigten sich als stabil gegenüber den auftretenden Scherkräften während des Kompartimentierungsschrittes. Ein kostengünstiges, kompaktes und spektroskopisches Messsystem mit integrierter Software zur fluidischen Steuerung der Kompartimentierung etc. und einer Datenbank für das Qualitätsmanagement in der Lebensmittelherstellung stand am Ende des Projektes als Labormuster bereit.

Manipulation von Zellen im Kompartiment

Ein Ziel der Forschung ist es, Zellen und Mikroorganismen in den Kompartimenten zu manipulieren. Beispielsweise sollen Zellen in bestimmten Bereichen konzentriert werden, was für den definierten Austausch von Zellmedium eine Voraussetzung ist. Eine Möglichkeit hierfür bietet die Anwendung elektrischer Felder, mit denen die Zellen zielgerichtet in bestimmte Bereiche des Kompartimentes bewegt werden können. Biologische Zellen sind im elektrischen Feld polarisierbar und erfahren im Fall einer nicht homogenen Ausbreitung des Feldes eine Kraftwirkung, die zu einer gerichteten Bewegung der Zellen führt. Dieser Effekt wird als Dielektrophorese bezeichnet. Im Fall von biologischen Objekten, wie beispielsweise Mikroorganismen oder Zellen, hat sich die Verwendung von Mikroelektroden zum Erzeugen der inhomogenen elektrischen Felder etabliert. Geeignete Mikroelektroden können hohe Feldstärken und Feldstärkegradienten [10] erzeugen.

Gemeinsam mit der Gruppe von Prof. Dr. M. Hoffmann am „IMN MacroNano®“ der TU-Ilmenau wurde ein mikrofluidisches System mit integrierten Mikroelektroden entwickelt. Dies System ist aufgrund der hydrophoben Oberflächeneigenschaften des Fluidkanals für segmentierte Flüsse geeignet. Bild 6 zeigt das Verhalten einer Hefekultur in einem Kompartiment, das im Bereich der Mikroelektroden positioniert wurde. Nach Anlegen einer Wechselspannung wandern die S. cerevisiae-Zellen zum Ort der maximalen Feldstärke (positive Dielektrophorese), die in diesem Fall an den Kanten der Elektroden auftritt.

Zusammenfassung und Ausblick

Vorteile des hier vorgestellten pipe-based-bioreactors-Systems sind folgende Punkte:

  • Schnelles HTS-System ohne Verdunstungsprobleme.
  • Keine Verunreinigungen zwischen zwei Kompartimenten.
  • Lange Inkubationen und Lagerung sind möglich (sicheres Qualitätsmanagement).
  • Kein vermindertes Bakterienwachstum durch zu geringe Sauerstoffversorgung, da diese über den semipermeablen Schlauch gesichert ist.
  • Selektion von verschiedenen Kompartimenten aus dem Trägerstrom ist möglich.
  • Ein geschlossenes System minimiert das Sicherheitsrisiko für Mensch und Umwelt.

In Verbindung mit der Nutzung des Systems pipe-based-bioreactors wird die in letzter Zeit sich gut entwickelnde Segmented-Flow-Technik in hervorragender Art und Weise unterstützt.

Anlässlich der MEDICA vom 16. bis 19.11.2011 in Düsseldorf wird vom iba Heiligenstadt ein „Gerätesystem zur Kompartimenterzeugung biologischer Medien“ als Exponat in Halle 3, Stand-Nr. 3H17 vorgestellt, welches Aufschluss über die vielfältige Nutzung des Systems für unterschiedliche Anwendungsfälle geben wird. Im Gespräch mit potenziellen Nutzern bietet das Institut auch die Möglichkeit von speziell zugeschnittenen Modifikationen für ganz spezielle nutzerspezifische Applikationen an.

Danksagung

Die Autoren danken dem BMBF, dem TMWBK, der AiF (im Rahmen des ZUTECH-Programms) und der EU im Rahmen des 7. FR für die erhaltene Förderung.

Literatur

  1. Martin, K., Henkel, T., Baier, V., Grodrian, A., Schöne, T., Roth, M., Köhler, J. M., Metze, J. (2003) Generation of large numbers of separated microbial populations by cultivation in segmented-flow microdevices. Lab Chip 3, 202-207.
  2. Grodrian, A., Metze, J., Henkel, T., Martin, K., Roth, M., Köhler, J. M. (2004) Segmented flow generation by chip reactors for highly parallelized cell cultivation. Biosens. Bioelectron. 19, 1421-1428.
  3. Köhler, J. M., Henkel, Th., Grodrian, A., Kirner, T., Roth, M., Martin, K., Metze, J. (2004) Digital reaction technology by micro segmented flow–components, concepts and applications. Chem. Eng. J. 101, 201-216.
  4. Henkel, T., Bermig, T. , Kielpinsky, M. , Grodrian, A., Metze, J., Köhler, J M., (2004) Chip modules for generation and manipulation of fluid segments for micro serial flow Processes, Chem. Eng. J., 101, 439-445.
  5. Baltz, R.H. (2006) Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration? J Ind Microbiol Biotechnol 33, 507–513.
  6. Rondon, M. R., Goodman, R. M., Handelsman, J. (1999) The earth´s bounty: assessing and accessing soil microbial diversity. Trends Biotechnol. 17, 403-409.
  7. geschützte Marke beim DPMA für das iba Heiligenstadt unter der Nr. 305 04 226.
  8. Schemberg, J., Grodrian, A., Römer, R., Gastrock, G., Lemke, K. (2009) Online optical detection of food contaminants in microdroplets, Eng. Life Sci. 2009, 9, No. 5, 391–397.
  9. Schemberg, J., Grodrian, A., Römer, R., Gastrock, G., Lemke, K. (2010) Application of segmented flow for quality control of food using microfluidic tools, Phys. Status Solidi A, 1–9 / DOI 10.1002 / pssa.200983315.
  10. Gastrock, G., Lemke, K., Metze, J. (2001) Sampling and monitoring in bioprocessing using micro-techniques, Reviews in Molecular Biotechnology, 123-135.
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