Fachbeitrag

Mikroskopie im Freien Fall

Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop liefert wichtigen Beitrag zur Gravitaxis
Dipl.-Biol. Sebastian Michael Strauch*) und Dipl.-Ing. Robert Ruthenberg**)
Bild 2: Fluoreszenzmikroskopie im Freien Fall: In einem speziellen Airbus A300 der französischen Firma NOVESPACE (Bild: Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg/DLR-Parabelflug: Deutsches Zentrum für Luft- und Raumfahrt e.V. (DLR), Köln).


  1. Lehrstuhl für „Ökophysiologie der Pflanzen“, Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
  1. Journalist, Nürnberg.
Woher wissen Einzeller, wo oben und unten ist? Diese zunächst simpel erscheinende Frage ist sehr schwer zu beantworten. Verfügen höhere Lebewesen, wie auch der Mensch selbst, dafür über komplexe Sinnesorgane, vor allem im Ohr, müssen Einzeller wie Euglena gracilis (Augentierchen) die Schwerkraftrichtung ohne Zuhilfenahme komplexer Organe wahrnehmen. Genau dieser Frage nach der Schwerkraftperzeption bei Einzellern gehen Forscher der Uni Erlangen-Nürnberg nach.

Gravitaxis ist die Reaktion eines freibeweglichen Organismus auf die Schwerkraft. Sie induziert eine orientierte Bewegung des Organismus entweder in Richtung des Schwerkraftvektors (= positive Gravitaxis) oder entgegen des Schwerevektors (= negative Gravitaxis). In älteren Publikationen wird auch der Begriff „Geotaxis“ verwendet (wegen der Richtung des Erdschwerevektors).

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Einzeller benötigen die Gravitaxis, um ans Licht bzw. an die Oberfläche eines Gewässers zu kommen, wo die Sonnenstrahlung für die Photosynthese am effektivsten ist. Durch ein Zusammenspiel von Gravitaxis und Phototaxis „regeln“ sich die Organismen im optimalen Bereich ein. Andere Organismen gelangen mit Hilfe der Gravitaxis an die Oberfläche, um sich fortzupflanzen. Die Chance, auf einen Partner zu treffen, ist dort deutlich höher als in den Tiefen des Gewässers.

Zurzeit gibt es verschiedene Hypothesen zur Gravitaxis von Einzellern, von denen die zwei wichtigsten im Folgenden genannt werden.

1. Passive Ausrichtung oder Bojen-Effekt: Das Hinterende der Zelle ist schwerer als das Vorderende und die Zelle richtet sich somit wie eine Boje aus. Die Flagelle am Vorderende bringt die Zelle automatisch nach oben.

2. Gravirezeptor: Die Zelle verfügt über einen physiologischen Rezeptor, mit dem sie die Richtung des Schwerefeldes wahrnimmt und durch eine physiologische Signaltransduktion eine gerichtete Kurskorrektur, z.B. durch einen modifizierten Geißelschlag, auslöst.

Die physiologische Signaltransduktion erfolgt durch die Weiterleitung des Signals vom Ort des Entstehens (Rezeptor) zum Ort der Reaktion (Geißel) unter Zuhilfenahme verschiedener zwischengeschalteter Proteine. Um die Fragen zur Gravitaxis von Einzellern endlich beantworten zu können, ist es sinnvoll, die Einzeller auch unter Schwerelosigkeit beobachten zu können.

Am Lehrstuhl für „Ökophysiologie der Pflanzen“ der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg erforscht Professor Dr. Donat-Peter Häder und seine 15 Mitarbeiter unter anderem die physiologischen Mechanismen anhand des Einzellers Euglena gracilis. Diese einzellige Grünalge zeigt ein präzises orientiertes Schwimmverhalten im Wasser. Dabei benutzt es externe Parameter wie Licht, Sauerstoff und Schwerkraft als Reiz.

Physikalische Reize

Es wurde bisher gezeigt, dass eine Vielzahl zellulärer Bestandteile eine Rolle in der Wahrnehmung und Weitergabe des Beschleunigungsreizes haben, von denen inzwischen einige durch molekularbiologische Methoden charakterisiert wurden. Um genauere Parameter während der Reorientierung zu erhalten, verwenden die Forscher das Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop BZ-8000 des Unternehmens Keyence. Damit sollen die genaue Reorientierung einer einzelnen Zelle sowie die interzellulare Calciumkonzentration, bestimmt durch calciumsensitive Fluoreszenzfarbstoffe, anhand des Einzellers Euglena gracilis aufgrund von Beschleunigungsreizen dokumentiert und analysiert werden.

In einem zweiten unabhängigen Experiment gilt es, die Photosynthese der Grünalge bei verschiedenen Beschleunigungen zu messen, um mögliche Effekte auf den photosynthetischen Apparat bei Hyper- und Mikrogravitation zu beobachten. Da während der Photosynthese Sauerstoff produziert und Kohlendioxid verbraucht wird, rücken photosynthetische Organismen als interessante Komponente für regenerative Lebenserhaltungssysteme immer mehr in den Blickpunkt. Diese Experimente stellen daher einen ersten Schritt der notwendigen detaillierten Studien über die photosynthetische Leistung von Euglena gracilis im Weltraum dar.
Sebastian Michael Strauch, Diplom-Biologe und Mitarbeiter von Professor Dr. Häder, nahm aus diesen Forschungsgründen an zwei Parabelflugkampagnen in 2006 sowie in 2007 teil. Neben den angestrebten Experimenten ging es bei der ersten Parabelflugreihe um die grundsätzliche Tauglichkeit des Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskops BZ-8000 bei Parabelflügen. Schließlich bieten diese nicht nur für rund 22 Sekunden nahezu Schwerelosigkeit, sondern vor und nach der Mikrogravitation (µg) werden die Gerätschaften mit dem 1,8fachen der Erdanziehung belastet. In der Regel versagen dabei ständig irgendwelche Festplatten der mitgenommenen Notebooks der zahlreichen Forscher, wie Strauch schmunzelnd erwähnt, so dass man alleine daran die hohen Belastungen der mitgebrachten Geräte erahnen kann.

Immerhin handelt es sich beim Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop Biozero aus der Modellreihe BZ-8000 um ein hochpräzises Mess- und Analysegerät. Es verfügt über einen eingebauten Dunkelraum, so dass erstmals Fluoreszenzmikroskopie in jedem hell erleuchteten Raum möglich ist, ohne dass die Probe Schaden nimmt. Es bietet die drei Betrachtungsarten Hellfeld-, Fluoreszenz- und Phasenkontrastbetrachtung. Wird die Betrachtung unterbrochen, schließt sich automatisch der Shutter für die Fluoreszenzanregung. Dadurch vermeidet man, dass die fluoreszierende Probe verblasst. Das Fluoreszenzmikroskop ist voll motorisiert (X-Y-Z-Achse, Filterwechsler, optischer Zoom). Über eine Firewire-Schnittstelle (IEEE1394) werden die Daten an einen Computer übertragen und über diese Schnittstelle wird das neuartige Fluoreszenzmikroskop auch gesteuert. Der optische Zoom erlaubt Vergrößerungen im Bereich 0,5- bis 3fach zusätzlich zur Vergrößerung des Objektivs (je nach Objektiv 4- bis 100fach) bei gleich bleibender numerischer Apertur. Das extrem kompakte Fluoreszenzmikroskop Biozero benötigt nur eine Stellfläche von 31 cm x 43 cm.

Beim Biozero können bis zu vier Filtersysteme gleichzeitig eingesetzt und über die elektronische Steuerung gewechselt werden. Mit nur einem Mausklick lassen sich Bilder, die mit unterschiedlichen Filtern erzeugt wurden, am vierfach geteilten Bildschirm gleichzeitig anzeigen. Durch Anklicken des jeweiligen Bildschirmabschnitts kann man zwischen den vier Kanälen umschalten und eine Mehrfarbüberlagerung durchführen.

Zahlreiche Messfunktionen, Bild-Farbstufen-, Bild-Sättigungs- sowie Bild-Helligkeitseinstellungen lassen sich per Mausklick ebenso komfortabel durchführen wie die Darstellung von Intensitätsmessungen und diverse Statistiken. Verschiedene Regelalgorithmen sowie Softwarefunktionen unterstützen den Bediener bei seinen Untersuchungen. Eine effektive Unschärfereduktion kann am Bildschirm in Echtzeit durchgeführt werden. Bei Bedarf lassen sich 3D-Analysen quasi in Echtzeit erstellen. Dank eines ausgeklügelten Algorithmus kann das 3D-Bild sehr rasch durch ein so genanntes Volume Rendering Verfahren (Visualisierung der Helligkeitsebenen von Punkten/Voxel in einem 3D-Raum) gezeichnet werden. Neben 3D-Rotationen und beliebigen 3D-Vergrößerungen kann der Benutzer auch Echtzeit-Farbanpassungen sowie Echtzeit-Kontrastanpassungen an den 3D-Bildern vornehmen.

Während der ersten Parabelflugkampagne wurden zahlreiche Filmsequenzen und Einzelbilder in diversen Modi aufgenommen. Dabei wurde die Empfindlichkeit der Kamera variiert, um ein optimales Verhältnis von Auflösung und Belichtungszeit zu erreichen. Der Z-Stack-Modus wurde verwendet, um Serienbilder automatisch aufzunehmen; dazu wurden die Abstände zwischen den Ebenen möglichst klein eingestellt. Die Filmaufnahmen zeigten den Übergang zwischen der Hyper-g- und µg-Phase und ließen einen Unterschied im Schlagmuster der Flagelle erkennen.

Fluoreszenzaufnahmen wurden versucht, allerdings waren die Belichtungszeiten deutlich zu lang und die Vibrationen beim Flug störten zu sehr. Zudem waren die Zellen zu beweglich, um sie ordentlich abzubilden. Videosequenzen zeigten die generelle Praktikabilität, wenn die Fluoreszenz stark genug und die Vergrößerung eher gering gewählt ist. Multicoloraufnahmen dauerten ebenfalls zu lang und die Montage der Bilder übereinander wäre schon wegen der Vibrationen nur mit statischen Motiven möglich gewesen.

Schließlich wurde das 60fach-Ölimmersionsobjektiv getestet. Dabei zeigte sich, dass der Immersionsöltropfen aufgrund der erhöhten Schwerkraft so stark deformiert wurde, dass das Bild stets aus dem Fokus lief und die Hyper-g-Phasen vor der eigentlichen Parabel nahezu komplett fehlten. In den µg-Phasen waren zwar gute Abbildungen möglich, allerdings wurden die Deckgläser so stark verzogen, dass vorher anvisierte Zellen oft nicht mehr zu finden waren. Dank einer ausreichend hohen Zelldichte konnten aber dennoch einige Zellen beobachtet werden.

Mehrfache g-Kräfte

Nach den drei Flügen an drei Tagen im Oktober 2006 mit insgesamt 93 Parabeln befand sich das Fluoreszenzmikroskop in einwandfreiem Zustand und arbeitete nach wie vor fehlerfrei. „Die rauen Bedingungen sind, soweit bis jetzt ersichtlich, spurlos an dem Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop Biozero vorübergegangen“, führte Biologe Strauch nicht ohne Stolz an.

Im November 2007 sollte es noch härter kommen und für zahlreiche Schweißtropfen auf den Stirnen der Keyence-Ingenieure sorgen, denn die Bioforscher wollten das Fluoreszenzmikroskop um 90° drehen und so mit auf den Parabelflügen mitnehmen. Der Hintergrund ist der, dass die Bewegungsfreiheit von Euglena gracilis dadurch vergrößert wird, da die Zellen in der nunmehr vertikal angeordneten Beobachtungsküvette nach oben schwimmen können.

Für die zweite Parabelflugkampagne wurde das Fluoreszenzmikroskop also um 90° gedreht und in einer extra angefertigten Styroporschale platziert. Erneut wurden insgesamt 93 Parabeln an drei Tagen geflogen. Diesmal wurde ausschließlich das schnelle Videobild des BZ-8000-Mikroskops genutzt. Diese Videofunktion mit einer Aufnahmedauer von bis zu einer Stunde vermag zeitliche Veränderungen am Objekt oder kleinste Bewegungsänderungen zuverlässig aufzuzeichnen und dann auch wiederzugeben. Aufgrund der Vielzahl an Einzelbildern sowie Informationen stehen erste Ergebnisse noch aus. Doch auch diese zweite Parabelflugkampagne hat das BZ-8000-Mikroskop einwandfrei überstanden. Ein Beleg dafür stellen die Aufnahmen dar, die beim Besuch des Lehrstuhls für „Ökophysiologie der Pflanzen“ im Oktober 2008 gemacht wurden.

Robust und zuverlässig

Wie Biologe Sebastian Michael Strauch unterstreicht, werden vor allem die Messfunktionen des Fluoreszenzmikroskops intensiv genutzt. Neben einer Längenmessfunktion von Geraden oder beliebigen Linien verfügen die BZ-8000-Mikroskope über weitere Messfunktionen wie Radiusbestimmungen, Mittelpunktmessungen, Kreisflächen- und Polygonbestimmungen sowie Winkel- und Parallelabstandsmessungen. Da der Messbalken stets mit eingeblendet wird, braucht man den Vergrößerungsfaktor nicht extra zu notieren.

Allerdings muss man beim Abspeichern von Bildern beachten, den Messbalken per Mausklick (Häkchen machen) mit abzuspeichern, sonst geht er verloren. Eine vollautomatische Abspeicherung wäre hier von Vorteil, merkt Strauch kritisch an.

Das Fluoreszenz-Phasenkontrast-Mikroskop Biozero wird am Institut von 2/3 aller Mitarbeiter intensiv und damit jeden zweiten Tag genutzt. Besonders möchte Strauch den guten Service des Keyence-Außendienstes loben: „Einmal ging ein Objektiv auf dem Postweg verloren. Der Keyence-Außendienst lieferte in nur einem halben Tag ein neues Objektiv, das nenne ich einen wirklich prompten Service.“

Die Experimente unter Schwerelosigkeit wären mittels konventioneller Fluoreszenzmikroskope nahezu unmöglich durchzuführen. Schließlich baut das Biozero extrem kompakt und alles ist in einem einzigen Gerät integriert. Ein konventionelles Fluoreszenzmikroskop besteht dagegen aus drei Geräten wie Laser, Kühlung und Steuerung und weist zudem sehr lange optische Wege auf, die unter Vibrationen für unscharfe Bilder sorgen.

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