Mittlerweile sind PFAS (Per- und Polyfluorierte Alkylsubstanzen) den meisten Menschen ein Begriff. Sie sind Kontaminanten, die nicht nur in der Umwelt, sondern in vielen Dingen des täglichen Lebens vorkommen. Diese künstlichen Substanzen, von denen es mehr als 4 000 Einzelverbindungen gibt und einige davon schon seit mehr als 80 Jahren in der Industrie eingesetzt werden, finden sich z. B. in Küchenartikeln, Funktionskleidung oder Kosmetik, allerdings geht die Europäische Behörde für Lebensmittelsicherheit (EFSA) davon aus, dass Lebensmittel der wichtigste Pfad für die PFAS-Aufnahme in den menschlichen Körper sind. Wissenschaftlich wurde nachgewiesen, dass die Hauptvertreter der PFAS (PFOS, PFOA, PFNA und PFHxS), im Folgenden "EU 4"-PFAS genannt, auf verschiedene Weise die Gesundheit beeinträchtigen und die Umwelt schädigen können. Aus diesem Grund hat die Europäische Union die Regulierung EU 2023/915 eingeführt und die Empfehlung (EU) 2022/1431 der Kommission zur Überwachung von PFAS in Obst, Gemüse, Milch und Babynahrung angenommen.

Bilder

Bild 1: Pipettierroboter Andrew+. © Waters

Bei der Entwicklung einer Methode zur Bestimmung von PFAS in Milch wurde der Roboter für folgende Aufgaben eingesetzt:

• Herstellung der Kalibrierstandards in Lösungsmittel
• Vorbereitung der Blindwert- und QC-Proben
• Probenvorbereitung: Clean-up mit Oasis GCB/WAX SPE-Kartuschen

Im Folgenden wird das Probenvorbereitungsprotokoll und die Ergebnisse der Methodenvalidierung betrachtet. In Bild 2 sind die drei Hauptschritte der Probenvorbereitung zur Bestimmung von PFAS in Milch schematisch dargestellt und in Bild 3 die entsprechende Konfiguration des Roboters aus der Vogelperspektive erklärt.

Bild 2: Schematische Darstellung des Probenvorbereitungsprotokolls für Milchproben für die PFAS-Analysen. © Waters

Für die Analysen wurde ein LC-MS/MS-System von Waters bestehend aus dem UPLC-System "ACQUITY™ Premier UPLC" mit "PFAS Analysis Kit" und dem Tandem-Quadrupol-Massenspektrometer "Xevo™ TQ Absolute" eingesetzt.

Extraktion

Die Extraktion der Zielverbindungen aus Milch erfolgt mit einer zweistufigen Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE). Dazu werden 2,5 g Milch mit den internen Standards dotiert und mit 2 ml 1 % Ameisensäure versetzt. Im Anschluss an 15 min im Ultraschallbad werden 5 ml Acetonitril zugegeben und nach dem Vortexen gekühlt zentrifugiert. Der Überstand wird anschließend abgenommen und die LLE mit 2 ml 60 : 40 Acetonitril/Wasser (v/v) wiederholt. Die Überstände aus beiden Extraktionen werden vereint und ein weiteres Mal gekühlt zentrifugiert. Damit ist die Probe für die Festphasenextraktion (solid phase extraction, SPE) vorbereitet und kann an den Pipettierroboter für das Clean-up mittels SPE übergeben werden.

SPE mit Dualphasen-Kartuschen

Bild 3: Konfiguration des Andrew+-Systems für die Bestimmung von PFAS in Milch mit einer Listung des benötigten Zubehörs. © Waters

Für die SPE kommen besondere Kartuschen des Typs Oasis GCB/WAX zum Einsatz: Dies sind Dualphasen-Kartuschen, die Aktivkohle und "HLB Weak Anion Exchange" als Sorbenzien in einer Kartusche vereinen (HLB steht für: Hydrophilic-Lipophilic-Balanced). Für die PFAS-Analytik bieten sie den Vorteil, auch neutrale Verbindungen, wie Perfluoroctansulfonamid (FOSA), in die Methode integrieren zu können.

Mit Hilfe der intuitiven "OneLab"-Software wurde ein Protokoll entwickelt, das alle Schritte der SPE zur Aufreinigung und Konzentration der Milchproben auf dem Andrew+-System automatisiert. Für zwölf Proben bedeutet das eine Laufzeit von zwei Stunden und vier Minuten. Durch die Automatisierung der SPE ist es demnach möglich, mehrere Proben-Batches an einem Tag aufzuarbeiten.

Im Einzelnen umfassen die Arbeitsschritte mit dem Roboter die Konditionierung der Kartuschen, das Beladen der Kartuschen mit Probe, das Spülen der Probengefäße und abschließend die Elution der Zielanalyten. Die Konditionierung der Kartuschen erfolgte in zwei Schritten: 1.) 15 ml 1 % Ammoniumhydroxid in Methanol und 2.) 5 ml 0,3 M Ameisensäure in Wasser, um die Ionenaustauscher der Wachskartusche zu aktivieren. Danach werden die Kartuschen mit dem Überstand der Extraktion beladen und die Probengefäße im Anschluss zunächst mit 10 ml Wasser und anschließend mit 5 ml 0,1 M Ameisensäure in Wasser/Methanol (1 : 1, v/v) gespült. Die dadurch vollständige Überführung der Probe auf die Kartusche ist gleichzeitig der Waschschritt zur Entfernung von Matrixkomponenten.

Validierungskenndaten für PFAS in Milch

Die Validierung der Methode wurde gemäß dem EURL-POP-Leitfaden für PFAS in Lebens- und Futtermitteln durchgeführt [2]. (EURL POP steht für: European Union Reference Laboratory for Halogenated Persistent Organic Pollutants in Feed and Food.) Dazu wurde haltbare Vollmilch mit 26 im Leitfaden gelisteten PFAS dotiert und Kalibriergeraden in einem Konzentrationsbereich von 0,00125 bis 5 µg/l im Vial, was 0,00025 bis 1 µg/kg in Milch entspricht, aufgenommen. Für die "EU 4"-PFAS lag das Bestimmtheitsmaß > 0,998 und für die weiteren Zielverbindungen > 0,99. Dabei lagen für alle aufgeführten PFAS die Signal-Rausch-Verhältnisse über 10. Einzige Ausnahme hier war PFUnDA (Perfluorundecansäure).

Bild 4: Darstellung der Wiederfindung von PFAS in Milch mit drei Dotierungskonzentrationen. Die roten Linien markieren die Toleranzbereiche definiert in der EURL-PFAS-Richtlinie. © Waters

Die Auswertung der Richtigkeit und Präzision ergab für die "EU 4"-PFAS die Einhaltung der im Leitfaden vorgegebenen ± 20 % Toleranz. Im Monitoring überschritt keine Substanz die vorgegebenen ±35 % für die Richtigkeit und ±25 % für die Präzision. Die Methode wurde weiterhin auf die Wiederfindung (apparent Recovery) bei LOQ, 10x LOQ und 100x LOQ (limit of quantitation) bewertet. Dabei lagen die "EU 4"-PFAS-Wiederfindungen zwischen 80 und 120 %, während mit Ausnahme von PFTrDS (Perfluortridecansulfonsäure), für das kein interner Standard verfügbar ist, die Wiederfindungen aller anderen PFAS zwischen 65 und 135 % lagen (s. Bild 4). Diese Ergebnisse entsprechen den Vorgaben des EURL-PFAS-Leitfadens.

Kontaminationsvermeidung

Die Vermeidung von Kontaminationen ist ein essenzieller Bestandteil der PFAS-Analytik im Spurenbereich und stellt im täglichen Arbeiten die größte Herausforderung dar. Wege zur Erkennung der Quellen und Vermeidung sind in einem White Paper von Waters beschrieben [4]. Eine Minimierung der Kontamination wurde bei dem hier verwendeten Roboter Andrew+ durch das Design der Extraktionseinheit und die in den Arbeitsablauf programmierten Schritte erreicht. Das Eluat aus den Kartuschen tropft direkt in die Sammelröhrchen, ohne die Oberflächen zu berühren. Es wurden Methanol-Spülschritte für alle Pipettenspitzen in den automatisierten Arbeitsablauf einprogrammiert. In einem Vergleich zwischen manueller und automatisierter Probenvorbereitung wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt.

Eine Kontaminationsquelle, die nur bedingt kontrollierbar ist, sind die Lösungsmittel und Additive. In der hier gezeigten Studie war das Extraktionslösungsmittel mit PFBA (Perfluorbutansäure) kontaminiert, was nicht beseitigt werden konnte und eine Belastung von rund 0,02 µg/kg PFBA in den Blindproben ergab. Aus diesem Grund konnte die Substanz bei der Auswertung der Validierung nicht berücksichtigt werden.

In einer vorangegangenen Arbeit zur Bestimmung von PFAS in Obst, Gemüse und Babynahrung zeigte sich, dass die entwickelte SPE-Methode zum Clean-up der Proben unter Verwendung der Oasis GCB/WAX Kartuschen keine akzeptable Wiederfindung für Capstone A und Capstone B ergibt [3]. Für diese zwitterionischen Verbindungen sind noch keine kommerziellen internen Standards erhältlich, so dass sich hier ein angepasstes Clean-up empfiehlt.

PFAS-Belastung in Milch

Die untersuchte Milchprobe enthielt PFOS und PFOA. Jedoch lagen die Befunde unterhalb des für die Methode festgesetzten LOQs von 0,005 µg/kg und damit ebenfalls unter den in (EU) 2022/1431 vorgegebenen maximalen Konzentrationen. Weitere PFAS, die mit der Methode in den Milchproben detektiert wurden, aber ebenfalls unterhalb des LOQs lagen, waren PFPeA (Perfluorpentansäure), PFHxA (Perfluorhexansäure), PFHpA (Perfluorheptansäure), PFBS (Perfluorbutansulfonsäure) und ADONA (Ammoniumsalz der Perfluor-4,8-dioxa-3H-nonansäure).

Fazit

In der bereits erwähnten Studie zur Quantifizierung von PFAS in Gemüse, Obst und Babynahrung unter Einhaltung der LOQs in (EU) 2022/1431 wurde eine Probenvorbereitungsmethode mit Verwendung von Dualphasen Oasis GCB/WAX SPE-Kartuschen entwickelt [3]. Die hier beschriebene Arbeit baut darauf auf, indem arbeitsintensive Schritte, wie das Herstellen von Standards und das SPE-Clean-up, mit einem Roboter automatisiert wurden. Die Ergebnisse der Validierung in Milch zeigen zum einen das Funktionieren der zuvor entwickelten SPE-Methode, der Automatisierung von Teilschritten sowie der LC-MS/MS-Methode für die PFAS-Analytik. Die Vorteile der hier gezeigten Automatisierung liegen neben der Zeitersparnis und der Vermeidung von Fehlern speziell für die PFAS-Bestimmung auch in einem geringen Kontaminationsrisiko.

Literatur

[1] Commission Recommendation (EU) 2022/1431, on the monitoring of perfluoroalkyl substances in food. L 221/105, 26.8.2022

[2] Guidance Document on Analytical Parameters for the Determination of Per- and Polyfluoroalkyl Substances (PFAS) in Food and Feed, Version 1.12, 11. Mai 2022, EURL POPs

[3] Dreolin N., Adams S., Organtini K., Hird S., Burt O. (2024) Analysis of 28 EU Regulated and Recommended PFAS in Food via LC-MS/MS – Part 1: Vegetable, Fruit, and Baby Food. Waters Application Note. 720008219.

[4] www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720007905en.pdf

AUTOREN
Dr. Claudia Rathmann, Dr. Tobias Langrock
Waters GmbH, Eschborn
Dr. Daniel Ng, Marcus Devakishen
Waters Corporation, Singapur
Kontakt: Waters GmbH, Eschborn
Tel.: 06196/400-600
[email protected]
www.waters.com