Bei der Probenvorbereitung muss man grundsätzlich unterscheiden zwischen einem sehr selektiven Clean-up für die meist zielgerichtete Analytik (Target Compound Analytik) und dem Workflow mit einer unspezifischen Probenvorbereitung für den zunehmenden Trend zu Non-Target-Analysen. Während bei der zielgerichteten Analytik möglichst alles, außer den Target-Substanzen, so strikt wie möglich abgetrennt werden soll, dürfen bei der Non-Target-Analytik naturgemäß nur "sanftere" Aufreinigungsverfahren angewendet werden. Eine weitestgehende Schonung der ins Visier genommenen Substanzklassen erstreckt sich dabei meist auf breitere Polaritätsbereiche, was es deutlich schwieriger macht, möglichst viele Matrixbestandteile davon abzutrennen. Hauptzielrichtung kann dann nur noch sein, besonders störende Komponenten aus der Matrix zu entfernen, ohne den breiten Non-Target-Bereich anzutasten. Eine solche generische Aufreinigung kann naturgemäß niemals so ausgeprägte Reinigungseffekte erzielen wie ein hochselektives, spezialisiertes Clean-up für die Target-Analytik.

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Bild 1: Gegenüberstellung von klassischen Einzel- bzw. Gruppenmethoden (links) im Vergleich zu einer einzigen Multimethode für Mykotoxine nach dem „Dilute and Shoot“-Prinzip (rechts). (Abkürzungen: DON: Deoxynivalenol; NIV: Nivalenol; Fus X: Fusarenon X; AcDON: Acetyl-Deoxynivalenol; ZON: Zearalenon; OTA: Ochratoxin A; Fumo: Fumonisin B1 u. B2.) © Wolfgang Brodacz

Für die Analytik von z. B. zwanzig zum Großteil durch gesetzliche Grenzwerte geregelte Mykotoxine völlig unterschiedlicher Klassen, müssen im vorliegenden Fall neun klassische Einzel- bzw. Gruppenmethoden durchgeführt werden. Diese meist genormten Methoden setzen alle auf möglichst selektive Reinigungsprozeduren, die großteils auf hochspezialisierten Immunoaffinitäts-Säulen (IAC) beruhen (Bild 1). Diese Einwegprodukte sind sehr teuer und mit einem hohen Arbeitsaufwand im Labor verbunden. Schließlich wird noch für jede Einzelsubstanz bzw. Gruppe eine jeweils maßgeschneiderte chromatographische Trennung, gefolgt von einem speziellen Detektionsverfahren, benötigt.

Aufgrund der großen physikalisch-chemischen Unterschiede dieser Mykotoxine ist kein gemeinsames Clean-up mehr möglich. Daher war es notwendig, eine Multiklassenmethode nach dem gut erweiterbaren "Dilute and Shoot"-Ansatz zu entwickeln.

Bei "Dilute and Shoot" wird die Probe extrahiert, was beim Mykotoxin-Beispiel schon den ersten Kompromiss beim Extraktionsmittel erzwingt. Der Rohextrakt wird lediglich in geringem Ausmaß (z. B. 1 : 10) verdünnt, und dann direkt, ohne zusätzliche Reinigung, dem Analysensystem zugeführt.

Die hohe Selektivität der Kombination von Chromatographie und Tandem-Massenspektrometrie ist für die "Dilute and Shoot"-Analytik nicht nur notwendig, sondern absolute Voraussetzung. Das darf aber nicht darüber hinwegtäuschen, dass unerwünschte Matrixbestandteile, selbst bei äußerst hoher MS-Selektivität, zu groben Störungen des gesamten chromatographischen und massenspektrometrischen Systems führen können. Dabei hilft die beste Selektivität des MS/MS-Systems wenig, wenn die Matrixeffekte bei der Ionisation so stark sind, dass nur noch wenige Prozent des Zielanalyten überhaupt ionisiert werden können (Ion Suppression).

In solchen Fällen ist eine Eliminierung des Großteils der störenden Matrixbestandteile von höchster Priorität für die Applikation. Eine sehr gute Möglichkeit, die Gesamtselektivität der Analytik schon vor dem Tandem-Massenspektrometer zu verbessern, ohne ein zeitaufwändiges und teures Clean-up vor der Chromatographie zu implementieren, ist die Verwendung der zweidimensionalen HPLC. Dabei können über orthogonale Selektivitäten der beiden unterschiedlichen LC-Phasen (z. B. HILIC und Reversed Phase) gute Ausschlussraten bei Matrixstörstoffen generiert werden. Das ist für einzelne oder wenige Zielanalyten mithilfe einer Trap zwischen den Säulen machbar, für eine größere Anzahl aber nicht mehr.

Bild 2: MRM-Chromatogramm einer Dilute-and-Shoot-Methode unter Verwendung eines Diverter-Schaltventils zur Ausblendung vor und nach dem Elutionsbereich der Mykotoxine (Lebensmittel-Zerealienmischung mit durchschnittlich 1/5 der Höchstwert-Belastung); 1 = Nivalenol, 2 = Deoxynivalenol, 3 = Fusarenon-X, 4 = 15-Acetyldeoxynivalenol, 5 = 3-Acetyldeoxynivalenol, 6 = Aflatoxin G2, 7 = Monoacetoxyscirpenol, 8 = Aflatoxin G1, 9 = Aflatoxin B2, 10 = Aflato-xin B1, 11 = Diacetoxyscirpenol, 12 = Fumonisin B1, 13 = HT-2 Toxin, 14 = T-2 Toxin, 15 = Fumonisin B2, 16 = Zearalenon, 17 = Ochratoxin A, 18 = Deoxynivalenol-3-Glucosid, 19 = Citrinin, 20 = Sterigmatocystin. © Wolfgang Brodacz

Schon bei der klassischen, eindimensionalen HPLC ist bei "Dilute and Shoot" von enormer Wichtigkeit, nur jenen Teil des HPLC-Eluates in das Massenspektrometer zu leiten, das die Zielanalyten enthält. Das gelingt ganz einfach über ein Säulenschaltventil (sog. "Diverter Valve"), das unmittelbar vor und nach Elution des oder der Zielanalyten das HPLC-Eluat in den Abfall leitet (Bild 2 links). Das ist eine besonders einfache und kostengünstige Maßnahme, dem Massenspektrometer nur jenen Elutionsbereich zuzuführen, der die Target-Komponenten enthält. Der Großteil der meist früh auf RP (Reversed Phase) eluierenden, polaren Störstoffe wird damit vor dem empfindlichen MS eliminiert. Sind zwischen den Analyten noch größere Fenster frei, kann auch dort, in Abhängigkeit von dort eluierenden Matrixbelastungen, zwischendurch in den Abfall abgeleitet werden.

QuEChERS-Methoden

Ein guter Kompromiss zwischen keinem und einem selektiven Clean-up sind vereinfachte Extraktions/Reinigungs-Kombinationen. Deren Grundprinzip beruht auf der Verteilung in einer Acetonitril/Wasser-Mischung bei Zugabe von anorganischen Salzen (Magnesiumsulfat, Natriumchlorid etc.). Dadurch sollen die Zielanalyten in die organische Phase gedrängt werden, während die polaren Matrixkomponenten in der Wasserschicht verbleiben. Derartige Methoden sind unter der Bezeichnung QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe) bekannt und in der Pestizidanalytik weit verbreitet. Verschiedene Varianten nutzen dabei unterschiedlichste Materialien (PSA, C18, C8 etc.) für die anschließende dispersive Festphasenextraktion (d-SPE).

Ihre Einfachheit, Flexibilität und gute Anwendbarkeit für Extraktionen mit leichter Vorreinigungswirkung zeigt sich meist in deutlich reduziertem Probenhandling und hat dadurch sehr stark zur Akzeptanz dieser Methode beigetragen. QuEChERS wird oft nur als einzige Reinigungsstufe vor der Injektion in den Gaschromatographen oder die HPLC angewandt. Die wichtigsten Argumente sind Zeitersparnis und reduzierte Kosten beim Verbrauch von Lösungsmittel und deren Entsorgung.

Im Einzelfall kann das aber dazu führen, dass diese Einsparung auf Kosten der Robustheit des chromatographischen Systems geht. Daher muss immer abgewogen werden, ob die Vorteile des schnellen Ergebnisses die Nachteile der höheren Belastung von Injektionssystem, Säule, Ionenquelle etc. aufwiegen.

Bild 3: Automatischer Workflow einer d-SPE-Probenreinigung im DPX-Format (Quelle: AppNote 1/2009 von Gerstel). © GERSTEL

Die dispersive Festphasenextraktion kann bei QuEChERS mittels "Disposable Pipette Extraction" (DPX) auch gut miniaturisiert und vollständig automatisiert werden. Im Vergleich zur klassischen SPE (Festphasenextraktion) befindet sich beim DPX-Format das SPE-Material frei beweglich innerhalb einer Pipettenspitze. Dadurch wird wesentlich weniger Probenvolumen benötigt. Außerdem lässt sich mittels durchgesaugter Luft eine intensive Durchmischung mit der flüssigen Probe erzwingen, was den Stoffaustausch stark beschleunigt.

Nach optionaler Konditionierung des speziellen Sorbens ("solid phase") mit Lösungsmittel startet die Extraktion durch Aufsaugen des QuEChERS-Rohextraktes ("sample") in die Pipettenspitze (Bild 3). Zur Intensivierung der Interaktionen mit der festen Phase erzeugt eine turbulente Durchmischung mit Luft eine Suspension von Sorbens und Probe ("mix", Mitte). Die hocheffiziente Extraktion dauert meist nur 30 Sekunden. Nach dem Ausstoß der Probenlösung kann das DPX-Material noch gewaschen werden, um unerwünschte Matrixstörstoffe zu entfernen. Abschließend werden die Zielanalyten direkt in die Autosampler-Vials eluiert, die sofort der LC und/oder GC zugeführt werden (Bild 3 von links nach rechts).

Besondere Herausforderungen ergeben sich bei der Probenvorbereitung für sehr ähnliche Analyt/Matrix-Kombinationen. Die Extraktion von polaren Komponenten aus Wasser ist eine besonders schwierige Applikation, bei der es nicht trivial ist, einen Differenzierungsmechanismus zu finden.

Fit für Purpose

Bei spezifischen Reinigungsmethoden werden in der Analytik gezielt die unterschiedlichen Eigenschaften (Flüchtigkeit, Polarität, Größenunterschiede etc.) zwischen Zielanalyten und störenden Matrixbestandteilen genutzt. Bei der Multi-Analytik ist das in zunehmenden Maße nicht mehr möglich. Für polarere und wasserhaltige Materialien ist daher oft die dispersive Festphasenextraktion (QuEChERS in verschiedensten Varianten) die unspezifische Vorreinigungsmethode der Wahl.

Wenn die Anzahl unterschiedlicher Analyten sehr groß ist, bzw. sie sich in ihren Eigenschaften stark unterscheiden und dadurch überhaupt kein gemeinsamer Differenzierungsmechanismus mehr gefunden wird, bleibt nur noch "Dilute and Shoot". Das bedeutet den Verzicht auf eine Reinigung mit "Schadensbegrenzung" durch Verdünnen.

AUTOR
Wolfgang Brodacz