Fachbeitrag

Fortschritte bei UV-VIS- Absorptionsmessungen

Untersuchung kleiner DNA/RNA-Probenvolumina
Bild 3a: Bestimmung der Absorptionslinearität mit einem UVmini-1240 und einem HellmaTrayCell/0,2-mm-Deckel – Absorptionsmesswerte und berechnete Konzentrationen.

Klin. Chem. Ph.D Cristiana Stefan*), Pascal Mannaert**)

  1. Kath. Universität Leuven, Medizinische Fakultät, Onkologische Abt., Belgien.
  2. Shimadzu Benelux, BB’s Hertogenbosch, Niederlande


In den letzten Jahren wurden neue Technologien für präzise UV-VIS-spektrophotometrische Messungen von Probenvolumina im Mikroliterbereich entwickelt. In dieser Hinsicht ist die Hellma TrayCell ein aktuelles optisches Zubehör, das zusammen mit einem Standard-Einstrahl-Spektrophotometer eine kostengünstige Alternative ist, um Probenkonzentrationen in unverdünnten Minimalvolumina festzustellen. Eine Hellma TrayCell ist eine innovative Neuerung auf diesem Gebiet und basiert auf Faseroptik kombiniert mit integrierter Strahlreflexionstechnologie (siehe Bild 1).


Bei der Hellma TrayCell (Bild 1 u. 2) handelt es sich um eine Mikrozelle mit faseroptischen Lichtleitern und integrierter Strahlumlenkung. Aufgrund dieser Eigenschaften wird eine Probe direkt auf die Oberfläche des optischen Messfensters aufgebracht und es lassen sich Messungen entweder mit dem 0,2-mm- oder dem 1-mm-Lichtwegdeckel mit Reflektorspiegel durchführen.

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Am wichtigsten ist, dass die Abmessungen der TrayCell mit einer Standardküvette übereinstimmen, so dass der Einsatz in herkömmlichen Spektrophotometern gesichert ist. Zwei austauschbare Deckel mit integrierter Strahlumlenkeinheit erzeugen einen definierten Lichtweg von nur 0,2 oder 1 mm. Daraus ergibt sich nominal ein scheinbarer Verdünnungsfaktor von 1:50 bzw. 1:10 in Bezug auf den Probengehalt.

Höher konzentrierte Proben, die mit den eher klassischen Küvetten (Lichtweg 5 oder 10 mm) nicht unmittelbar gemessen werden können, lassen sich mit einer Hellma TrayCell ohne vorherige Verdünnung bestimmen. Eine Probe wird direkt auf die Oberfläche des optischen Messfensters gegeben, wobei die empfohlenen Volumina nur 0,7...4 µl für den 0,2-mm-Deckel oder 3...5 µl für den 1-mm-Deckel betragen.

Eine andere wertvolle Eigenschaft besteht darin, dass eine Hellma TrayCell während der Probenbefüllung, -rückgewinnung oder der Reinigung im Photometer verbleibt, wodurch nicht nur optische Stabilität, sondern auch eine geringere Durchgangszeit hinsichtlich der Messungen garantiert wird. Eine zurückgewonnene Probe kann bei Bedarf für eine weitere Analyse verwendet werden.

Das Ziel dieser vorläufigen Untersuchung war es, die Absorptionsmessungen mit einer Hellma TrayCell im Shimadzu Spektrophotometer UVmini-1240 (Bild 1) mit solchen Messungen zu vergleichen, bei denen eine klassische 10-mm-Ultramikroküvette zur Anwendung kommt. Letztere entspricht einer geschwärzten Zelle mit einem 10-mm-Strahlengang, einem 2,5 x 2 mm großen Messfenster und einem Minimum von 70 µl an benötigtem Probenvolumen.

Das UVmini-1240 ist ein eigenständiges UV-VIS-Einstrahl-Spektrophotometer mit einer spektralen Bandbreite von 5 nm. Das System verwendet ein konkaves (aberrationskorrigiertes) holografisches Gitter als Monochromator und eine Silizium-Photodiode als Detektor. Der Wellenlängenmessbereich liegt zwischen 190 und 1100 nm. Die integrierte Software enthält Menüs mit Grundfunktionen, die einen Photometrie-Modus für feste Wellenlängen, einen Spektrum-Modus für Wellenlängenbereiche und einen Quantifizierungsmodus zur Analyse einzelner Komponenten einschließen. Darüber hinaus sind wahlweise diverse Programmpakete für bestimmte Forschungsanwendungen wie Multiwavelength-Messungen, Kinetik und Protein-Analytik erhältlich.

Die Untersuchung konzentrierte sich auf Nukleinsäure-Messungen bei 260 nm unter Einsatz einer Plasmid-DNA-Probe. Ihre Konzentration wurde willkürlich als „Referenz“ betrachtet, sofern sie mit der klassischen 10-mm-Ultramikroküvette gemessen wurde. Die Messungen wurden an Hand von Verdünnungsstufen (1:50, 1:100, 1:200 und 1:400) durchgeführt und eine durchschnittliche Probenkonzentration von 1,725 µg/µl erhalten (CV = 4,3 %, s. Bild 4). Die Konzentration wurde des Weiteren in einer Hellma TrayCell mit 4 µl der unverdünnten Probe bestimmt. Mit dem 0,2-mm-Deckel wurde eine durchschnittliche Absorption von 0,664 erhalten (n = 4, CV = 3,7 %), entsprechend einer mittleren Konzentration von 1,661 µg/µl (Bild 5). Die Linearität der Absorptionsmessungen mit dem Hellma TrayCell/0,2 mm-Deckel wurde als nächstes anhand verschiedener Probeverdünnungen (n = 7) bewertet (Bild 3). Im Rahmen dieser Analyse deckten die Absorptionswerte den Intervallschritt 0,069...0,69 ab und die durchschnittliche Probenkonzentration betrug 1,694 µg/µl (n = 7, CV = 6,4 %). Eine Korrelationsanalyse zeigte ausgezeichnete Linearitätsparameter (r2 = 0,9992; y = 0,6951x - 0,0023); ein Hinweis darauf, dass Messungen mit der unverdünnten Probe sich im linearen Bereich befanden. In vergleichbaren Studien wurden auch Messreihen mit dem 1-mm-Deckel unternommen und eine durchschnittliche Probenkonzentration von 1,614 µg/µl (n = 5, CV = 2,7 %) gefunden.

Abschließend bleibt festzustellen, dass eine Hellma TrayCell die Erwartungen erfüllt, wenn sie mit dem Shimadzu UVmini-1240 eingesetzt wird – nämlich eine genaue Analyse geringer Volumina mit bemerkenswerter Reproduzierbarkeit. Diese Protein-Untersuchung wurde repräsentativ ausgewählt und berücksichtigt komplexere Prüfprozeduren.

Eine exakte Messung kleiner Volumina unverdünnter Nukleinsäureproben ist von besonderem Wert für die klinische Translationsforschung mit Genexpression als Schwerpunktforschung. Dabei erlauben geringe Mengen Patientenmaterial, wie beispielsweise Biopsien, nur begrenzte Volumina an messbaren DNA/RNA enthaltenden Proben. Der Einsatz einer für Absorptionsmessungen eingestellten Hellma TrayCell ist auch zu rechtfertigen, wenn größere DNA/RNA-Probenvolumina verfügbar sind, da sich auf diese Weise verdünnungsbedingte Fehler ausschalten lassen und durch eine geringere Durchgangszeit schnellere Ergebnisse möglich sind.
Weitere Informationen zu dem hier beschriebenen Gerätesystem erteilt Nils Garnebode, E-Mail nga@shimadzu.de

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