Matrixunabhängige Proteinanalyse

Dumas – Ein gut etabliertes Verfahren zur N/Proteinanalyse

Das Dumas-Verfahren zeigt in mehrfacher Hinsicht deutliche Vorteile gegenüber der Kjeldahl-Methode. Über die Vorzüge informiert der folgende Beitrag.

Bei der Analyse mit dem rapid MAX N exceed werden die Proben in wiederverwendbare Edelstahltiegel eingewogen. Die Probenzufuhr erfolgt über einen automatischen Probengeber mit bis zu 90 Probenpositionen. © Elementar
Die Bestimmung des Proteingehalts ist essentiell für die Qualitätskontrolle und Nährwertkennzeichnung in der Nahrungs- und Futtermittelindustrie und für Forschungseinrichtungen. Der Proteingehalt ist oftmals direkt mit Produkteigenschaften und -klassifizierungen verbunden, z. B. bei der Schaumbildung und beim Geschmack von Bier oder der Unterscheidung zwischen Stärke und glutenfreier Stärke. In allen Anwendungsbereichen sind hochpräzise, matrixunabhängige Proteinanalysen erforderlich. 

Der Proteingehalt kann durch verschiedene spezifische und unspezifische physikalische und chemische Nachweisverfahren quantifiziert werden. Zwei automatisierbare Verfahren zur Absolutbestimmung des Proteingehalts sind weithin akzeptiert: das nasschemische Verfahren nach Kjeldahl und das Hochtemperatur-Verbrennungsverfahren nach Dumas. Als weiteres Analyseverfahren kann die Nahinfrarotspektroskopie (NIRS) angewendet werden. Dieses relative Bestimmungsverfahren benötigt allerdings für jeden Probentyp eine separate, externe Kalibrierung.

Über 100 Jahre lang wurde hauptsächlich das Kjeldahl-Prinzip zur Bestimmung des Gesamtproteingehalts genutzt, und es wird in den meisten Normen beschrieben. Diese nasschemische Analyse ist jedoch zeitraubend, arbeitsintensiv, und es werden gefährliche und toxische Chemikalien benötigt. Dies ist heute im Hinblick auf Laborsicherheit, aber auch aus wirtschaftlichen Gründen nicht mehr erwünscht. Das erklärt die Tendenz der letzten Jahre, dass die Kjeldahl-Methode immer mehr von der Methode nach Dumas verdrängt wird.

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Dumas vs. Kjeldahl 

Bild 1: Funktionsprinzip der Dumas-Analyse des rapid N exceed®. © Elementar

Das Dumas-Prinzip beruht auf der quantitativen Verbrennung der Probe. Dies geschieht bei 950 °C in einer mit Sauerstoff angereicherten Umgebung. Während der Verbrennung wird der gesamte Stickstoff in der Probe in Stickoxide umgewandelt, diese werden anschließend zu Stickstoff reduziert und mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor (WLD) quantifiziert. Alle anderen Verbrennungsgase werden vor der Quantifizierung entfernt. Bild 1 beschreibt das Funktionsprinzip des rapid N exceed® von Elementar, der mit der EAS Regainer®-Technologie arbeitet. Diese führt zu einer signifikanten Kostenreduzierung pro Analyse.

Bei der Kjeldahl-Methode wird im ersten Schritt die Probe bei 420 °C für 90 Minuten mit konzentrierter Schwefelsäure und einem Katalysator chemisch aufgeschlossen. Bei diesem Prozess wird der Stickstoff in der Probe in Ammoniumsulfat umgewandelt. In einem zweiten Schritt wird Natriumhydroxid zur Ammoniumlösung gegeben. Das freigesetzte Ammoniak wird destilliert und in eine Borsäurelösung überführt. Der Ammoniumborat-Komplex wird schließlich mit Schwefelsäure oder Salzsäure titriert. Eine typische Analyse dauert nach dieser Methode mindestens 100 Minuten.

Obwohl die Prinzipien der Kjeldahl- und Dumas-Methode unterschiedlich sind, bestimmen beide den Gesamtstickstoffgehalt der Probe. Daraus wird mit einem spezifischen Umrechnungsfaktor der Proteingehalt berechnet. Der Faktor variiert abhängig von dem relativen Gehalt an verschiedenen Proteinen und ihrer Aminosäurezusammensetzung zwischen 5,70 und 6,25.

Mit beiden Verfahren kann nicht zwischen Protein- und Nicht-Protein-Stickstoff unterschieden werden. Häufig sind die mit der Dumas-Methode erzielten Ergebnisse etwas höher. Dies kann mit einer besseren Wiederfindung im Vergleich zu Kjeldahl begründet werden.

Es gibt zahlreiche wissenschaftliche Veröffentlichungen, die sich mit einem Vergleich der beiden Methoden für eine breite Palette unterschiedlicher Probentypen beschäftigen. In Anbetracht der Tatsache, dass der berechnete Proteingehalt in beiden Verfahren nur auf Näherungen basiert, ist die sorgfältige Auswahl des Berechnungsfaktors von größter Wichtigkeit. Eine Umwandlung der Kjeldahl- in Dumas-Werte ist mit entsprechenden Koeffizienten, die von Simonne et al. [1] für ausgewählte Lebensmittelgruppen vorgeschlagen wurden, möglich. In vielen Fällen ist die Differenz zwischen beiden Verfahren allerdings statistisch nicht signifikant wie z.B. Željko et al. [2] gezeigt haben.

Durchsatz und Arbeitsaufwand

Bild 2: Automatischer Probengeber. © Elementar

Für Dumas-Analysen ist die Probenvorbereitung einfach und schnell. Proben werden entweder in Zinnschiffchen oder in wiederverwendbare Edelstahltiegel eingewogen. In beiden Fällen dauert die Probenvorbereitung weniger als eine Minute, bevor die erste Messung gestartet werden kann. Zum Beispiel ermöglichen bis zu 90 Probenpositionen des rapid MAX N exceed unbeaufsichtigte Betriebszeiten von mehr als sieben Stunden (Bild 2). Dementsprechend können an einem normalen Arbeitstag bis zu 200 Proben gemessen werden.

Bild 3: Vergleich des typischen täglichen Betriebs von Dumas- und Kjeldahl-Analysatoren. © Elementar

Im Gegensatz dazu müssen für die Kjeldahl-Analysen nicht nur die Proben eingewogen, sondern auch die exakten Mengen an Schwefelsäurelösung und Katalysator-Tabletten dazugegeben werden. Die vollständige Analyse dauert mindestens 100 Minuten. Es ist allerdings möglich, den täglichen Durchsatz mittels Batch-Arbeitsweise zu erhöhen. Dieser Ansatz hat eine Obergrenze von 20 Proben pro Batch, da bei dieser Anzahl die benötigte Zeit für die Durchführung des Destillations-Titrations-Schritts der gesamten Batch und die Zeit für den Aufschluss identisch sind. Dadurch können maximal 100 Proben pro Tag mit einem Kjeldahl-Analysator gemessen werden (s. Bild 3). Obwohl beide Schritte automatisiert ablaufen, muss der Probentransfer zwischen den beiden Modulen manuell durchgeführt werden. Dementsprechend beträgt die unbeaufsichtigte Betriebszeit nur 100 Minuten.

Kosten pro Analyse

Traditionell werden in Dumas-Analysatoren erhitzte Metalle wie Kupfer oder Wolfram verwendet, um den überschüssigen Sauerstoff zu binden und gebildete Stickoxide zu N2 zu reduzieren. Unter Berücksichtigung der Analyse aller Verbrennungsgase wird das Reduktionsmittel normalerweise nach 200 – 300 Proben zu einem inaktiven Metalloxid oxidiert. Deswegen ist das Reduktionsmittel, zusammen mit dem Trägergas, der Hauptkostenfaktor. Die von Elementar entwickelte EAS Regainer-Technologie erhöht die Lebensdauer des Reduktionsmittels erheblich. Daher belaufen sich die Kosten pro Analyse einschließlich aller erforderlichen Reagenzien und Gase auf ca. 0,25 Euro für den rapid N exceed und 0,49 Euro für den rapid MAX N exceed.

Bild 4: Vergleich Reagenzienverbrauch für 2000 Proben. © Elementar

Die Hauptkostenfaktoren für Kjeldahl-Analysen sind die Kosten für Chemikalien, deren Entsorgung und Personalkosten. Die Gesamtkosten pro Analyse betragen hier ca. 6,00 Euro. Die entstandene Menge an chemischen Abfällen aus einer typischen Kjeldahl-Analyse für 2 000 Proben beträgt 560 Liter im Vergleich zu einer vernachlässigbaren Menge von nur 0,1 Liter (430 g) Feststoff für den rapid N exceed (Bild 4). Das EAS Regainer-Reagenz wird während der Analyse allmählich und rückstandsfrei aufgebraucht. Es ist außerdem zu beachten, dass die Arbeitskosten noch nicht in die Berechnungen miteinbezogen sind. Zusammengefasst: Mit der Dumas-Methode können mit einem Gerät mindestens doppelt so viele Proben pro Tag analysiert werden wie mit Kjeldahl, bei deutlich reduzierter (ca. minus 35 %) Arbeitszeit.

Fazit

Es wurde erläutert, inwiefern das Dumas-Verfahren in Bezug auf Laborsicherheit, Probendurchsatz, Arbeitszeit, der Menge an chemischen Abfällen und somit Kosten pro Analyse deutliche Vorteile gegenüber der Kjeldahl-Methode hat. Darüber hinaus führt die hohe Automatisierung zu einem geringeren Fehlerrisiko.

Mit den von Elementar entwickelten N/Proteinanalysatoren wurden die Kosten pro Analyse, verglichen mit den „klassischen“ Dumas-Analysatoren, drastisch reduziert. Das rechtfertigt unserer Ansicht nach die Investition in einen rapid N exceed wirtschaftlich auch für Laboratorien, die z. B. nur zehn Proben pro Tag messen. Außerdem besteht die Möglichkeit den Probendurchsatz in Zukunft noch erhöhen zu können. Die geringen Investitionskosten für Entry-Level-Kjeldahl-Analysatoren sind unserer Ansicht nach heutzutage nicht mehr das Schlüssel-Verkaufsargument. 

Literatur

[1] Simonne, A.H., Simonne, E.H., Eitenmiller, R.R., Mills, H.A., Cresman III, C.P. 1997. Could the Dumas method replace the Kjeldahl digestion for nitrogen and crude protein determinations in foods? Journal of the Science of Food and Agriculture, 73:39-45.

[2] A.M., Sandra M.J., Nadežda, B.P., Željko, N.Ć., Milica, M.Ž., Comparison of the Kjeldahl method, Dumas method and NIR method for total nitrogen determination in meat and meat products Journal of Agroalimentary Processes and Technologies 2015, 21(4), 365-370.

AUTOREN

Dr. Martina Stumpp
Dr. Lutz Lange
Elementar Analysensysteme GmbH

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