GC-Tipp

Quantifizierung in der SPME: Eine einfache Sache, wenn man sich an alle Regeln hält

Der Fall
Auch mehr als 20 Jahre nachdem die SPME (Solid Phase Micro Extraction) eingeführt wurde und sich mittlerweile als die Mikroextraktionsmethode etabliert hat, gibt es immer noch viele GC-Anwender, die SPME für eine nur qualitative Probenvorbereitungstechnik halten. Dem spricht schon entgegen, dass es beispielsweise mit den ISO-Normen 27108 (Bestimmung von Pflanzenschutzmitteln in Wasser), ISO 17943 (Bestimmung von leichtflüchtigen organischen Verbindungen in Wasser) oder der EPA-Methode 8272 (Bestimmung von PAKs in Sedimentwasser) verschiedene offizielle Methoden zur Quantifizierung von Schadstoffen (neben vielen weiteren Methoden) mit der SPME gibt. Wie in allen anderen analytischen Techniken muss man sich für reproduzierbare und quantifizierbare Ergebnisse einfach an ein paar wichtige Regeln halten.

Bild 1: Extraktion verschiedener Verbindungen aus dem Headspace einer wässrigen Probe mit SPME in Abhängigkeit von der Extraktionsdauer.

Lösung
Der wichtigste Punkt bei der SPME ist, dass es sich um eine Technik handelt, bei der sich zwischen der Faser und der Probe ein Gleichgewicht einstellt (ganz im Gegensatz zur SPE, Festphasenextraktion, bei der immer das Ziel ist, idealerweise 100 % der Analyten zu retardieren). Für eine erfolgreiche Quantifizierung müssen alle Parameter konstant gehalten werden, die dieses Gleichgewicht beeinflussen. Diese Parameter sind:

  • Extraktionszeit.
  • Temperatur (ausreichende Equilibrierungszeit für die Probe beachten).
  • pH-Wert der Probe.
  • Salzgehalt/Ionenstärke der Probe.
  • Rührgeschwindigkeit (oder auch die Intensität alternativer Agitationsarten) und Position der Faser im Probengefäß.
  • Probengefäßgröße und -form, Volumen der Probe.
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Ein paar Bemerkungen zu den verschiedenen Punkten: Das Konstanthalten der Extraktionszeit ist vor allem dann wichtig, wenn Gleichgewicht noch nicht erreicht ist (Bild 1).

Bild 2: Schematische Darstellung des Geschwindigkeitsprofils in einem Probengefäß mit Rühren durch Magnetrührer.

Nach Erreichen des Gleichgewichts wirken sich kleinere Variationen der Extraktionszeit nicht mehr auf die Analytmenge auf der Faser aus. Mit einem Autosampler ist aufgrund der exakt zeitlich gesteuerten Schritte die Anwendung kurzer Extraktionszeiten bereits vor Erreichen des Gleichgewichts gut möglich. Wenn man mit der SPME anfängt, werden die ersten Experimente sicher manuell durchgeführt (wobei naturgemäß kleinere zeitliche Schwankungen auftreten). Hierbei sollte die Extraktionsdauer so gewählt sein, dass man sich schon im oder nahe dem Gleichgewicht befindet.

Für Extraktionen im Headspace hat die Temperatur einen größeren Einfluss auf das Gleichgewicht als bei Extraktionen in der flüssigen Probe (wobei allerdings auch im letzteren Fall eine Erhöhung der Temperatur die Zeit für die Gleichgewichtseinstellung reduzieren kann). Mit steigender Temperatur werden sich einerseits mehr Analytmoleküle im Headspace befinden, im Gegenzug werden allerdings weniger Moleküle von der SPME-Faser absorbiert, so dass die ideale Temperatur im Rahmen der Methodenentwicklung bestimmt werden muss. Im Allgemeinen werden bei Headpace-SPME Temperaturen von 40...60 °C angewendet.

Über den pH-Wert können geladene Moleküle in den ungeladenen Zustand überführt werden und lassen sich so besser von den unpolaren SPME-Fasern extrahieren. Eine Änderung des pH-Wertes der Probe kann somit die Extraktionsausbeute und somit die Empfindlichkeit erhöhen. Ein Beispiel hierfür ist die Extraktion von Phenolen aus einer wässrigen Probe. In Tabelle 1 sind die Peakflächen in Abhängigkeit vom pH-Wert dargestellt. Eine Erniedrigung des pH-Wertes führt zu erhöhten Peakflächen, weil die Phenole undissoziiert vorliegen. Im Sinne von Reproduzierbarkeit und Quantifizierung muss natürlich der pH-Wert aller Proben und Kalibrationslösungen gleich eingestellt werden.

Tabelle 1: Extraktion verschiedener Phenole mit SPME (85 μm Polyacrylat-Faser, Eintauchen der Faser in die Probe) aus wässriger Matrix. Die Werte mit der höchsten Peakfläche sind fett markiert. Aus: Bulletin 923 „SPME: Theory and Optimization of Conditions” (Literatur-Code BQT, T198923), ©1998 Sigma-Aldrich Co.

Für eine zuverlässige Quantifizierung muss der Salzgehalt natürlich konstant gehalten werden. Bringen die Proben schon eine Salzkonzentration mit, sollten diese mit Salz gesättigt werden, um so eine reproduzierbare Ionenstärke zu gewährleisten. Durch steigenden Salzgehalt werden generell viele organische Analyte stärker aus der wässrigen Phase in den Dampfraum oder auf die unpolare Faser getrieben. Auch hier dient die Extraktion von Phenolen aus wässriger Matrix als Beispiel (Tabelle 1). Daher sollte für viele Extraktionen der Salzgehalt (bspw. mit Natrium- chlorid) erhöht werden, um eine verbesserte Empfindlichkeit zu erzielen.

Die Rührgeschwindigkeit ist sowohl bei Headspace-Extraktion als auch Extraktion durch Eintauchen ein wichtiger Parameter für die Gleichgewichtseinstellung, da bei beiden die Diffusion von der einen in die andere Phase (Headspace: aus der flüssigen Probe in die Gasphase; Eintauchen: aus der flüssigen Phase in die stationäre Phase der Faser) der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist und das Rühren die Dicke der Diffusionsschicht bestimmt. Speziell für Extraktionen durch Eintauchen ist die Position und Tiefe der SPME-Faser in der flüssigen Probe wichtig, da sich durch das Rühren ein Strömungsprofil mit unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten an verschiedenen Positionen im Probengefäß ausbildet (Bild 2).

Die Menge an Analyt, die auf der Faser absorbiert wird, ist über folgende Gleichung bestimmt:

n = kVPC0VP/kVP+ VP

(mit n = Menge Analyt auf Faser, k = Verteilungskonstante zwischen Faser und Probe, VF = Volumen der Faser, VP= Volumen der Probe, C0 = Konzentration des Analyten in der Probe).

Für große Volumina (10...15 ml oder größer) kann diese Gleichung zu

n = kVPC0

vereinfacht werden. Daher sollten immer möglichst große Probenvolumina gewählt werden, um eine erschöpfende Extraktion zu vermeiden. Da das Oberfläche-Volumen-Verhältnis ebenfalls einen Einfluss auf das Gleichgewicht hat, ist es wichtig, immer das gleiche Probenvolumen zu wählen und auch die Probengefäßgröße und -form (letztere beeinflusst auch das Oberfläche-Volumen-Verhältnis) konstant zu halten.

Zu allerletzt muss noch hervorgehoben werden, dass für eine erfolgreiche Quantifizierung immer mit internen Standards gearbeitet werden sollte. Interne Standards sollten ähnliche Eigenschaften wie die Zielverbindungen besitzen, aber natürlicherweise in der Probe nicht vorkommen (bspw. isotopenmarkierte oder fluo-rierte Verbindungen der gleichen Molekülgröße und Substanzklasse). Diese werden vor der Extraktion in bekannter Menge zugegeben, um Variationen der Probe hinsichtlich der Extraktions- und Desorptionseffizienz zu kompensieren.

Das Fazit
Die Quantifizierung in der SPME ist eine einfache Sache, wenn man sich immer wieder bewusst macht, dass SPME eine Gleichgewichtstechnik ist und somit alle Parameter, die die Extraktion beeinflussen können, konstant gehalten werden müssen. Bei diesen Parametern kann es sich auch um Kleinigkeiten wie der Einstichposition der Nadel ins Probengefäß handeln.

Die Verwendung eines Autosamplers bei Probenvorbereitung mit der SPME bietet für die Quantifizierung deutliche Vorteile, da hier das Konstanthalten von Parametern wie Extraktionszeit, Temperatur, Rührgeschwindigkeit und Einstichposition und -tiefe der SPME-Faser automatisch erfolgt. Punkte wie pH-Wert, Salzgehalt oder Volumen der Probe müssen natürlich vom Anwender konstant gehalten werden.

Aus dem demnächst erscheinenden Buch „GC-Tipps“, Herausgeber Dr. Stavros Kromidas.

Dr. Frank Michel, Sigma-Aldrich Chemie GmbH

Autor:
Dr. Frank Michel
Sigma-Aldrich Chemie GmbH
Eschenstraße 5
82024 Taufkirchen
E-Mail: frank.michel@sial.com

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