Sowohl bei komplexen Analysen als auch bei Standardtrennungen kann die SFC klare Vorteile bieten. Dank ihrer hohen Selektivität und Umweltverträglichkeit wird sie zu einem vielversprechenden Werkzeug in verschiedenen Branchen. Nach kontinuierlichen Weiterentwicklungen zeigte sich die SFC als effiziente Alternative zur Gaschromatographie (GC) und Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Im Vergleich zur GC weist die SFC eine höhere Lösungsmittelkompatibilität und Trennleistung für polare Verbindungen auf, während sie sich von der HPLC durch ihre ökologische Verträglichkeit und kürzere Analysezeiten abhebt. Zunächst im Folgenden Grundlegendes zur Methode.

Bilder

Bild 1: Phasendiagramm für Kohlenstoffdioxid (CO2). © Shimadzu

Dieses besondere Verhalten wird in der SFC genutzt: Hier werden überkritische Fluide als mobile Phase eingesetzt. Der überkritische Zustand kann z. B. bei Kohlendioxid leicht bei 31,1 °C (304,25 K) und 73,8 bar (Bild 1) erreicht werden – also einfache Bedingungen für ein klassisches HPLC-System. Überkritisches CO₂ ist ein gutes Lösungsmittel für eine Vielzahl von Substanzen und kann daher als mobile Phase eingesetzt werden, um eine präzise Trennung von Verbindungen zu ermöglichen. Die "Überlegenheit" der SFC gegenüber herkömmlichen Trenntechniken wie der HPLC liegt maßgeblich in der Nutzung dieser Eigenschaften von überkritischem CO₂, die eine verbesserte Selektivität, Effizienz und Umweltverträglichkeit ermöglichen.

Durch die geringe Viskosität und einen hohen Diffusionskoeffizienten ist mit überkritischem CO₂ eine hohe lineare Geschwindigkeit (Fließgeschwindigkeit in Bezug auf den Säulenquerschnitt) möglich. Der Diffusionskoeffizient beeinflusst, wie schnell sich ein Gleichgewicht zwischen stationärer und mobiler Phase einstellt. Normalerweise führt eine höhere lineare Geschwindigkeit in der HPLC zu einem höheren Säulendruck. (Der obere Bereich des Säulendrucks ist durch das Gerätedesign und die Eigenschaften der Säule begrenzt.) Doch CO₂ hat im überkritischen Zustand eine geringere Viskosität als Wasser und andere organische Lösungsmittel, die üblicherweise für die HPLC verwendet werden. So sind mit der SFC kürzere Analysezeiten als bei der HPLC möglich, ohne Verlust an Auflösung und des Trennverhaltens – und das bei niedrigeren Säulendrücken (Bild 2).

Bild 2: Vergleich zweier Chromatogramme von Tocopherolen mit HPLC und SFC. © Shimadzu

Die vorteilhaften Eigenschaften von Kohlendioxid sind vielseitig. So weist es in niedrigen Konzentrationen eine geringe Toxizität auf, ist recht kostengünstig und in der Regel verfügbar. Im Gegensatz zu Flüssigkeiten (im Normalzustand), die kaum komprimierbar sind und deren Dichte sich bei Druckschwankungen nicht ändert, lässt sich überkritisches CO₂ komprimieren, was zu Veränderungen der physikalischen Eigenschaften und des Trennverhaltens führt. Diese Eigenschaften können wiederum genutzt werden, um viele Möglichkeiten in der Methodenentwicklung zur Lösung schwieriger Trennprobleme anzugehen.

Nur für unpolare Substanzen?

Das CO₂-Molekül weist kein elektrisches Dipolmoment auf. Daher kann überkritisches CO₂, ähnlich wie bei der Normalphasen-Chromatographie, hauptsächlich für lipophile und unpolare Substanzen verwendet werden. Um die Eigenschaften der mobilen Phase anzupassen und somit besondere Selektivitäten und Lösungen für spezielle Trennprobleme zu ermöglichen, werden daher in der Praxis zusätzlich organische Modifikatoren wie Methanol oder Ethanol genutzt. Hierin liegt auch ein Vorteil der SFC gegenüber der HPLC, da sie bis in den polaren Analytbereich vordringen kann, wobei das tatsächliche Polaritätslimit noch in Forschungsarbeiten ermittelt werden muss [4]. Als Faustregel kann man sich aber merken: Alles, was sich in Methanol lösen lässt, kann auch per SFC analysiert werden.

In der pharmazeutischen Industrie z. B. wird die SFC wegen ihrer sehr guten Trennleistung bei chiralen Verbindungen und Trennproblemen als Standardinstrument häufig eingesetzt. Die SFC eignet sich sowohl für chirale als auch für achirale Trennungen und wird oft in Verbindung mit massenspektrometrischer Detektion eingesetzt. Dabei ist die Empfindlichkeit entscheidend. Geräte der Serie Nexera UC von Shimadzu beispielsweise ermöglichen einen splitlosen Transfer ins Massenspektrometer, was erfahrungsgemäß zu einer fünffachen Intensitätssteigerung im Vergleich zu Split-Kopplungen führt. Für kritische Trennungen ist ein Start beim Gradienten mit minimalem Modifikatoranteil entscheidend. Das kann bei früh eluierenden Substanzen zu einer verbesserten Auflösung führen. Da der überkritische Zustand nur unter Druck aufrechterhalten werden kann, ist eine zuverlässige Rückdruckregelung unerlässlich. Schwankungen im Druck haben einen signifikanten Einfluss auf die Trennung und die Retentionszeiten. Der Rückdruckregulator SFC-30A aus der Nexera-Serie wurde beispielsweise speziell für solche Anwendungen optimiert. Er zeigt äußerst geringe Druckschwankungen von weniger als 0,5 bar, was zu reproduzierbaren und stabilen Retentionszeiten führt.

Die SFC hat großes Potenzial in der analytischen und präparativen Flüssigchromatographie, da sie einen großen Bereich an Analyten abdeckt. Auch durch die orthogonale Selektivität oder für wässrige Lösungen bietet sie Vorteile.

Weitere Betrachtung

Auch wenn die SFC für viele Anwendungen eine bedeutende Alternative zur herkömmlichen HPLC oder GC darstellt – es sollten auch sicherheitsrelevante und ökologische Aspekte kritisch betrachtet werden. In Sachen Sicherheit, Kosten und Umweltbelastung überwiegen die Vorteile.

Kohlendioxid weist selbst bei komprimierter Verwendung ein niedriges Explosionsrisiko auf und ist nicht brennbar. Im Vergleich zu anderen organischen Lösungsmitteln ist es von Natur aus wenig toxisch, zudem chemisch inert und nicht korrosiv. Weiter ist die hohe Verfügbarkeit zu nennen, was CO2 auch aus ökonomischen Aspekten interessant macht.

Technische Aspekte

Dennoch gibt es bei der Implementierung von SFC verschiedene Hindernisse und auch Grenzen. Im analytischen Maßstab ist die geringe Toxizität des freigesetzten CO₂normalerweise kein Problem, da nur geringe Mengen entstehen und durch lokale Absaugungen oder die Verwendung eines Abzugs leicht kontrolliert werden können. Auf der präparativen Ebene ist es jedoch wichtig, eine effektive Absaugung des verdampften CO₂, z. B. mit speziellen Hauben für einen Fraktionssammler, zu gewährleisten.

Eine weitere Herausforderung kann die Bereitstellung von CO₂ darstellen. Wenn keine Infrastruktur vorhanden ist, und je nach Größenordnung der SFC, werden möglicherweise Baumaßnahmen oder die Installation eines Sicherheits-Gasschranks notwendig. Was in der analytischen SFC meist wenig problematisch ist, kann in der präparativen SFC entscheidend sein. So kann eine zuverlässige Versorgung mit ausreichenden CO₂-Mengen bei Hochdurchsatzanwendungen meist nicht mehr über Flaschenlieferungen erfolgen. Obwohl diese Investition zunächst kostenintensiv sein kann, macht sie sich in den meisten Fällen recht schnell durch gesteigerten Durchsatz und verbesserte Effizienz bezahlt.

Chromatographische Aspekte

Trotz ihrer Vorteile kann die SFC auch chromatographisch an ihre Grenzen stoßen, insbesondere bei der Auswahl der Säule, die unter Umständen ein umfangreiches Methoden-Screening erfordern kann. Es ist wichtig zu beachten, dass sich die Retentionsreihenfolgen, die man aus der HPLC kennt, sich in der SFC möglicherweise verändern. Grundsätzlich können aber die meisten Säulenmaterialien, die sowohl in der Normalphasen- als auch in der Umkehrphasen-Chromatographie verwendet werden, problemlos in der SFC eingesetzt werden.

Zudem kann die Detektion eine Herausforderung darstellen, da im Gegensatz zur HPLC im gesamten System, einschließlich nach der Trennsäule, ein hoher Gegendruck herrscht. Daher sind robuste Detektoren erforderlich, die diesem Druck standhalten können, um eine zuverlässige Analyse zu gewährleisten. Die meisten erhältlichen Detektoren verfügen aber über optionale Detektorzellen für den Hochdruckbereich.

Fazit

Die SFC bietet als effektive Methode für die präparative Reinigung von Zielsubstanzen, für chirale Trennungen und Routineanalysen klare Vorteile. So ist die SFC z. B. in der Pharmaindustrie fest etabliert. Die SFC zeichnet sich nicht nur durch ihre Leistungsfähigkeit aus, sondern auch durch ihre ökonomische Nachhaltigkeit als "grünere Chromatographie". Und die Nutzung von CO₂ als Lösungsmittel ist wegen seiner hohen Verfügbarkeit auch wirtschaftlich interessant.

Literatur:
[1] Gros, Q., Duval, J., West, C., Lesellier, E.; On-line supercritical fluid extraction-supercritical fluid chromatography (SFE-SFC) at a glance: A coupling story. TrAC Trends in Analytical Chemistry; 2021; 144: 116433.
[2] Communications to the editor. The Journal of Organic Chemistry; 1962; 27(2): 700–706.
[3] Zosel, K.; Studiengesellschaft Kohle mbH. Process for the decaffeination of coffee. United States patent 4260639A; 1970.
[4] Veuthey, J.-L.; LCGC Europe; 2017; Vol. 30, Issue 11, 609–610.

AUTOR
Stephan Neumann
Produktspezialist HPLC Shimadzu Deutschland, Duisburg
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