Bakterielle Biofilme zeigen im Vergleich zu einzelnen Bakterien eine erhöhte Toleranz gegenüber Antibiotika und chemischen Desinfektionsmitteln. Das Verständnis der Ursachen dieses Phänomens ist von grundlegender Wichtigkeit für die Entwicklung besserer Strategien zur Bekämpfung solcher Infektionen.

Bakterielle Biofilme existieren in komplexen, dynamischen Umgebungen mit komplizierten Signalmechanismen. Die Herausforderung bei der Untersuchung und Manipulation solcher dynamischer Systeme besteht in der Messung und Kontrolle der unmittelbaren Umgebung, gekoppelt mit konstanter Überwachung von Veränderungen und Ergebnissen über längere Zeiträume. Auch bei anscheinend einheitlichen Populationen, welche den Biofilm bilden, hat die sorgfältige Steuerung und Manipulation des Mikromilieus überraschende fundamentale Signalmechanismen zum Vorschein gebracht, die vollkommen neue Zugänge zur antibakteriellen Therapie eröffnen.

Eine der größten technischen Herausforderungen für die langfristige Zellanalyse ist die Möglichkeit der Steuerung von Temperatur, Gas und Nährstoffzusammensetzung des Umfeldes der Zellen während der Dauer des Experiments, ohne dabei die Aufnahmebedingungen zu stören. Diese werden durch die Nähe der Mikroskopelemente (Objektivlinse, Kondensor, Objekttisch) sowie durch die Notwendigkeit eines unbehinderten Strahlenganges durch die Probe ohne Behinderung der Bewegung von Objekttisch oder Objektiv erschwert.

Diese Herausforderungen bei der Lebendzellanalyse können durch die Verwendung von Zellkulturen auf Mikrofluidbasis gemeistert werden; diese verwenden Fluidik- und Zellkammern mit sehr kleinen Volumina, was dynamische Veränderungen von Gas- und Temperaturbedingungen ermöglicht. Eine solch kleine Inkubationskammer ermöglicht dem Anwender präzise und schnelle Änderungen der Gas- oder Temperaturbedingungen während der Experimente mit lebenden Zellen, ohne die optische Analyse zu stören. So können nunmehr Experimente durchgeführt werden, die bislang nur schwer machbar waren. Somit stellt eine Mikrofluidik-Plattform eine vielversprechende Basis dar, auf der noch bessere Lebendzell-Inkubationssysteme mit dynamischer Kontrolle konstruiert werden können.

Dieser Artikel fasst zwei neuere Publikationen zur CellASIC® ONIX Mikrofluid-Zellkulturplattform (Merck, Darmstadt; Bild 2) für die Untersuchung und Manipulation bakterieller Biofilme zusammen [1,2].

Entwicklung einer kontrollierbaren Biofilm-Fluidikkammer

Bakterielle Biofilme bestehen aus Millionen von Zellen und können bei entsprechendem Zugang zu Nährstoffen eine beträchtliche Heterogenität aufweisen. Am Biofilmwachstum forschende Wissenschaftler haben dieses Mikromilieu in einer kontinuierlich beobachtbaren Kultur reproduziert. Verwendet wurden die CellASIC® ONIX Mikrofluidik-Plattform und eine modifizierte Version der Y04D Mikrofluidik-Platte (Merck). Diese Platte hat ungewöhnlich große Kammern, welche die Bildung großer Zellkolonien mit Millionen von Bakterien ermöglichen, den Fluss des Mediums aber nicht einschränken (Bild 3). Die außerordentliche Größe der Kammer trug auch dazu bei, das Problem des Aneinanderklebens von Bakterien bzw. deren Anheftung an Oberflächen zu reduzieren.

Der Medienfluss in der Mikrofluidik-Kammer war vollständig kontrollierbar und wurde von einer pneumatischen Pumpe von der Plattform aus betrieben. Der durch die Pumpe erzeugte Druck wurde während der Dauer des Experiments stabil gehalten. Bei den meisten Experimenten wurde ein Pumpendruck von 1 psi mit nur einem geöffneten Einlasskanal für Medium verwendet (die Y04D-Platte verfügt über sechs Einlasskanäle); dies entspricht einer Fließgeschwindigkeit von 16 µm/s in der Wachstumskammer. Da die Mikrofluidik-Kammer kontinuierlich auf dem Objekttisch bleiben konnte, wurden Zeitrafferaufnahmen des Wachstums der Biofilmkolonie unter Verwendung der Phasenkontrastmikroskopie gemacht (Bildaufnahme alle 10 min und anschließende Auswertung mittels Bildanalyse-Software; Bild 4).

Schwankungen beim Biofilmwachstum und elektrische Signalgebung

Dank der Live-Aufnahmen lässt sich das Wachstum des Biofilms beobachten. Die Mikrofluidikkultur-Plattform kann zur Erforschung von Konflikten innerhalb des bakteriellen Biofilms verwendet werden: Zellen an der Peripherie des Biofilms schützen die Zellen im Inneren vor externen Attacken, hungern sie aber auch aufgrund ihres Nährstoffkonsums aus (Bild 5). Die Forscher entdeckten, dass Biofilme diesen Konflikt durch weiträumige gegenseitige metabolische Abhängigkeit zwischen Peripherie und Innerem des Biofilms lösten.

Diese gegenseitige Abhängigkeit führt zu periodischem Anhalten oder Schwankungen des Biofilmwachstums, wodurch die inneren Zellen vor Verhungern geschützt werden. Der Konflikt zwischen Schutz und Aushungern scheint durch diese Schwankungen gelöst zu werden, und dieser Prozess macht die Bakterien möglicherweise resistenter gegen Attacken durch Antibiotika und andere chemische Substanzen.

In einer weiteren Studie befassten sich die Forscher mit der Frage, wie die Zellen ihre metabolischen Zustände über so lange Distanzen von der Peripherie des Biofilms bis in dessen Inneres koordinieren. Es hat sich gezeigt, dass die Kaliumkanäle der Bakterien eine aktive elektrische Kommunikation und eine überraschende Koordination mit der periodischen Dynamik des Biofilms ermöglichen. Der die periodische Signalgebung vermittelnde Kaliumionenkanal gestattet den Zellen eine rasche Kommunikation über deren metabolischen Zustand und fördert so die zuvor entdeckte weitreichende gegenseitige metabolische Abhängigkeit in Biofilmen.

Schlussfolgerung

Diese neue Technologie unterstützt die Forscher dabei, neue Arten von Daten zu erhalten und daraus neue Einblicke in die biologischen Mechanismen zu gewinnen. Das CellASIC® ONIX Mikrofluidik-System bietet gegenüber herkömmlichen Zellkulturen, welche nur schwer genau zu kontrollieren sind, signifikante Vorteile. Die Mikrofluidik-Plattform wurde spezifisch für die Steuerung der Zellkulturparameter, Reduzierung der Komplexität sowie zur Schaffung eines stabilen, manipulierbaren Mikromilieus entwickelt. Sie kann zur Durchführung von Langzeituntersuchungen der Dynamik bakterieller Biofilme eingesetzt werden.

Mit dieser Plattform sind die Wissenschaftler nunmehr in der Lage, die Lokalisation von Biofilmen zu begrenzen und ihr Wachstum zu steuern, indem einzelne Zellen beobachtet werden und ihre Koordination und Interaktionen sowie ihr komplexes Umfeld erforscht werden. Auf diese Art und Weise will man verstehen, wie die Zellen durch soziale Lebensweisen beeinflusst werden.

Dies konnte mit zahlreichen Bakterienspezies bei Langzeitkulturen, Fluorenzenzquantifizierung und Nährstoffmanipulation gezeigt werden. Zudem sollten die einfache Anwendung sowie die Flexibilität und Zugänglichkeit dieser innovativen Technologieplattform für ein breites Spektrum an Anwendungen in der bakteriellen Zellbiologie von Nutzen sein.

Literatur:

[1] Liu J, Prindle A, Humphries J, Gabalda-Sagarra M, Asally M, Lee DD, Ly S, Gacia-Ojalvo J, Suel GM. Metabolic co dependence gives rise to collective oscillations within biofilms. Nature 2015 Juli 523:550-554.

[2] Prindle A, Liu J, Asally M, Ly S, Garcia-Ojalvo J, Suel GM. Ion channels enable electrical communication in bacterial communities. Nature. 2015 Nov 5;527(7576):59-63.

Dr. Gurol Suel, Professor der Molekularbiologie, San Diego, CA, USA (gurols@yahoo.com) und Dr. Jintao Liu, Postdoc-Stipendiat, Suel Lab, San Diego, CA, USA (physfan@hotmail.com)